Assay optimization for molecular detection of Zika virus Translated title: Optimisation des tests pour la détection moléculaire du virus Zika Translated title: Optimización de la prueba para la detección molecular del virus de Zika Translated title: تحسين الاختبارات المخصصة للكشف الجزيئي عن فيروس زيكا Translated title: 寨卡病毒分子检测的试验优化 Translated title: Оптимизация молекулярных методов выявления вируса Зика

Abstract

Objective

To examine the diagnostic performance of real-time reverse transcription (RT)-polymerase chain reaction (PCR) assays for Zika virus detection.

Methods

We compared seven published real-time RT–PCR assays and two new assays that we have developed. To determine the analytical sensitivity of each assay, we constructed a synthetic universal control ribonucleic acid (uncRNA) containing all of the assays’ target regions on one RNA strand and spiked human blood or urine with known quantities of African or Asian Zika virus strains. Viral loads in 33 samples from Zika virus-infected patients were determined by using one of the new assays.

Findings

Oligonucleotides of the published real-time RT–PCR assays, showed up to 10 potential mismatches with the Asian lineage causing the current outbreak, compared with 0 to 4 mismatches for the new assays. The 95% lower detection limit of the seven most sensitive assays ranged from 2.1 to 12.1 uncRNA copies/reaction. Two assays had lower sensitivities of 17.0 and 1373.3 uncRNA copies/reaction and showed a similar sensitivity when using spiked samples. The mean viral loads in samples from Zika virus-infected patients were 5 × 10 ⁴ RNA copies/mL of blood and 2 × 10 ⁴ RNA copies/mL of urine.

Conclusion

We provide reagents and updated protocols for Zika virus detection suitable for the current outbreak strains. Some published assays might be unsuitable for Zika virus detection, due to the limited sensitivity and potential incompatibility with some strains. Viral concentrations in the clinical samples were close to the technical detection limit, suggesting that the use of insensitive assays will cause false-negative results.

Résumé

Objectif

Étudier la performance diagnostique des tests basés sur l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel après transcription inverse (RT) pour détecter le virus Zika.

Méthodes

Nous avons comparé sept tests publiés utilisant la RT-PCR en temps réel et deux nouveaux tests développés par nos soins. Afin de déterminer la sensibilité analytique de chaque test, nous avons conçu un acide ribonucléique synthétique de contrôle universel (ARNcun) contenant toutes les régions ciblées par les tests sur une hélice ARN et enrichi de l’urine ou du sang humain de quantités connues de souches africaines ou asiatiques du virus Zika. Les charges virales dans 33 échantillons provenant de patients infectés par le virus Zika ont été déterminées à l'aide de l'un des nouveaux tests.

Résultats

Les oligonucléotides des tests publiés utilisant la RT-PCR en temps réel ont présenté jusqu'à 10 mauvais appariements potentiels avec la lignée asiatique provoquant l'épidémie actuelle, alors qu'on a constaté de 0 à 4 mauvais appariements dans le cas des nouveaux tests. La limite de détection inférieure à 95% des sept tests les plus sensibles variait de 2,1 à 12,1 copies d'ARNcun/réaction. Deux tests présentaient des sensibilités plus basses de 17,0 et 1373,3 copies d'ARNcun/réaction et montraient une sensibilité similaire lorsque des échantillons enrichis étaient utilisés. Les charges virales moyennes dans les échantillons provenant de patients infectés par le virus Zika étaient de 5 × 10 ⁴ copies d'ARN/mL de sang et de 2 × 10 ⁴ copies d'ARN/mL d'urine.

Conclusion

Nous proposons pour détecter le virus Zika des réactifs et des protocoles actualisés, adaptés aux souches responsables de la flambée actuelle. Tous les tests publiés ne permettent pas de détecter le virus Zika en raison d'une sensibilité limitée et d'une incompatibilité potentielle avec certaines souches. Les concentrations virales dans les échantillons cliniques étaient proches de la limite de détection technique, ce qui laisse penser que l'utilisation de tests insensibles donnera des résultats faussement négatifs.

Resumen

Objetivo

Examinar el rendimiento del diagnóstico de las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) en tiempo real para la detección del virus de Zika.

Métodos

Se compararon siete pruebas de RT-PCR en tiempo real publicadas y dos pruebas nuevas que se han desarrollado. Con el fin de determinar la sensibilidad analítica de cada prueba, se construyó un ácido ribonucleico sintético de control universal (uncRNA) que contenía todas las regiones objetivo de las pruebas en una hebra de RNA y se añadió a sangre u orina humana con cantidades conocidas de cepas de virus de Zika de Asia o África. Se determinaron las cargas víricas en 33 muestras procedentes de pacientes infectados por el virus de Zika a través de una de las pruebas nuevas.

Resultados

Los oligonucleótidos de las pruebas de RT-PCR en tiempo real publicadas mostraron hasta 10 posibles discordancias con el linaje de Asia causante de los brotes actuales, en comparación con 0 de 4 discordancias en el caso de las pruebas nuevas. El límite de detección inferior del 95% de las siete pruebas más sensibles abarcó de 2,1 a 12,1 copias/reacción de uncRNA. Dos pruebas mostraron sensibilidades inferiores de 17,0 y 1373,3 copias/reacción de uncRNA y presentaron una sensibilidad similar al usar muestras infectadas. Las cargas víricas medias en las muestras procedentes de pacientes infectados por el virus de Zika fueron de 5 × 10 ⁴ copias de RNA/mL de sangre y de 2 × 10 ⁴ copias de RNA/ml de orina.

Conclusión

Se proporcionan reactivos y protocolos actualizados para la detección adecuada del virus de Zika en el caso de las cepas de brotes actuales. Algunas pruebas publicadas pueden no ser adecuadas para la detección del virus de Zika, debido a la limitada sensibilidad y a la posible incompatibilidad con algunas cepas. Las concentraciones víricas en las muestras clínicas se acercaron al límite de detección técnico, lo que sugería que el uso de pruebas intensivas causaría resultados falsos negativos.

ملخص

الغرض

دراسة الأداء التشخيصي لاختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي (PCR) مع إنزيم النسخ العكسي (RT) لاكتشاف الإصابة بفيروس زيكا.

الطريقة

قمنا بإجراء مقارنة بين سبعة اختبارات منشورة لتفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي مع إنزيم النسخ العكسي (RT‑PCR) واختبارين جديدين تم إعدادهما من جانبنا. ولتحديد الحساسية التحليلية لكل اختبار، قمنا بتكوين الحمض النووي الريبوزي الاصطناعي للمكافحة العامة (uncRNA) والذي يحتوي على جميع المناطق المستهدفة في الاختبار في شريط RNA واحد ويحتوي على مؤشرات للدم أو البول البشري الذي يحتوي على كميات معروفة من سلالات فيروس زيكا في منطقة أفريقيا أو آسيا. وتم تحديد الحمولات الفيروسية في 33 عينة صادرة من مرضى مصابين بفيروس زيكا باستخدام أحد الاختبارات الجديدة.

النتائج

أظهرت الأوليغونيكليوتيدات الخاصة باختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي مع إنزيم النسخ العكسي ما يصل إلى 10 حالات محتملة من عدم التطابق مع السلالة الآسيوية المسببة للعدوى الحالية، بالمقارنة مع حالات عدم التطابق بالنسبة للاختبارات الجديدة بمعدل 0 إلى 4. تراوح حد الاكتشاف المنخفض بنسبة 95‏% في الاختبارات السبعة الأكثر حساسية من 2.1 إلى 12.1 من نسخ سلالات uncRNA لتفاعل كل حالة. وُجد لدى اثنين من الاختبارات درجات منخفضة من الحساسية بمقدار 17.0 و1373.3 لنسخ سلالات uncRNA لتفاعل كل حالة وأظهرت وجود درجة حساسية مماثلة عند استخدام عينات المؤشرات. بلغ متوسط الحمولات الفيروسية في العينات الصادرة عن المرضى المصابين بفيروس زيكا 5 × 10 ⁴ نسخ من RNA لكل ملليلتر من الدم و 2 × 10 ⁴ نسخ من RNA لكل ملليلتر من البول.

الاستنتاج

نحن نوفر الكاشفات وأحدث البروتوكولات لاكتشاف فيروس زيكا والتي تناسب سلالات العدوى الحالية. وقد تكون بعض الاختبارات المنشورة غير مناسبة لاكتشاف فيروس زيكا نظرًا لوجود درجة محدودة من الحساسية واحتمالية عدم توافقها مع بعض السلالات. كانت نسب تركيز الفيروسات في العينات التحليلية قريبة من حد الاكتشاف التقني، مما يشير إلى أن استخدام الاختبارات التي تفتقد إلى الحساسية سيؤدي إلى إصدار نتائج خاطئة وسلبية.

摘要

目的

旨在检查针对寨卡病毒检测的实时逆转录 (RT)-聚合酶链反应 (PCR) 试验的诊断性能。

方法

我们比较了 7 种公布的实时 RT-PCR 试验和我们开发的两种新试验。 为了确定各种试验的分析灵敏度，我们构建了在一个 RNA 链上包含所有试验目标区域的合成通用对照核糖核酸 (uncRNA) 以及带有已知数量的非洲或亚洲寨卡病毒株的加标人体血液或尿液。 通过使用一种新的试验测定 33 个寨卡病毒感染患者样本的病毒载量。

结果

已公布的实时 RT-PCR 试验的寡核苷酸，显示出与亚洲血统潜在的失配率高达 10，相比之下，新试验的失配率为 0 至 4。 七种最敏感试验的 95% 检测下限范围为 2.1 至 12.1 uncRNA 拷贝/反应。 两个试验中 17.0 和 1373.3 uncRNA 复制/反应的灵敏度较低，使用加标样本时表现出类似的灵敏度。 寨卡病毒感染患者的样本中，血液的平均病毒载量为 5 × 10 ⁴ RNA 拷贝/毫升，尿液的平均病毒载量为 2 × 10 ⁴ 拷贝/毫升。

结论

我们为适合当前疫情的寨卡病毒检测提供试剂和更新方案。 由于有限的灵敏度以及与一些菌株潜在的不兼容性，因此一些公布的试验可能不适合寨卡病毒检测。 临床样本中的病毒含量接近于技术检测极限，这表明使用不敏感试验将会引起假阴性结果。

Резюме

Цель

Изучить диагностические возможности выявления вируса Зика с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскриптазой (ОТ) в режиме реального времени.

Методы

Авторы сравнили семь методов ОТ-ПЦР, сведения о которых были опубликованы в литературе, и два новых метода, разработанные авторами. Для выявления аналитической чувствительности каждого метода были сконструированы синтетические универсальные контрольные рибонуклеиновые кислоты (ункРНК), содержащие все целевые участки на одной из цепей РНК. Эти РНК были добавлены к образцам крови или мочи пациентов, содержащих вирус Зика африканского или азиатского происхождения в известных количествах. Одним из новых методов определялась вирусная нагрузка для 33 образцов пациентов, зараженных вирусом Зика.

Результаты

Олигонуклеотиды для опубликованных методов ОТ-ПЦР показали до 10 потенциальных несовпадений при определении вируса азиатского происхождения, вызвавшего нынешнюю вспышку заболеваемости, тогда как новые методы показали от 0 до 4 несовпадений. Для семи наиболее чувствительных анализов 95%-й нижний порог определения составлял от 2,1 до 12,1 копии ункРНК на реакцию. Два метода продемонстрировали меньшую чувствительность (от 17,0 до 1373,3 копии ункРНК на анализ) и сходную чувствительность при использовании образцов с добавлением ункРНК. Средняя величина вирусной нагрузки в образцах пациентов, инфицированных вирусом Зика, составила 5 × 10 ⁴ копий РНК/мл для крови и 2 × 10 ⁴ копийРНК/мл для мочи.

Вывод

Авторы предлагают реактивы и обновленные протоколы для выявления вируса Зика, вызвавшего нынешнюю вспышку заболевания. Некоторые из методов, по которым имеются опубликованные литературные данные, могут быть неподходящими для текущей ситуации из-за ограниченной чувствительности и потенциальной несовместимости с некоторыми штаммами вируса. Концентрация вируса в клинических образах была близка к техническому пределу определения, что позволяет предположить, что использование нечувствительных методов может приводить к получению ложноотрицательных результатов.