Фено- и генотипический портрет штаммов Yersinia pestis филогрупп 2.MED4 и 2.MED1 – этиологических агентов вспышек чумы ХХ века в Прикаспийском регионе Translated title: Pheno- and genotypic characteristics of Yersinia pestis strains of phylogroups 2.MED4 and 2.MED1 – etiological agents of plague outbreaks of the 20th century in the Caspian Sea region

Abstract

Проведен сравнительный анализ фенотипических и генотипических характеристик штаммов возбудителя чумы филогрупп 2.MED4 и 2.MED1 средневекового биовара основного подвида из эпидемически активных в ХХ веке очагов чумы Прикаспийского региона. По результатам анализа определены биохимические свойства, питательные потребности и плазмидный профиль штаммов филогрупп 2.MED4 и 2.MED1 средневекового биовара Y. pestis. Выявлена генетическая вариабельность в генах hemS, caf1М и ssaJ, ассоциированных с вирулентностью, у штаммов линии 2.MED. Полученные данные по фенотипическим и генотипическим характеристикам средневекового биовара могут найти свое применение в лабораторной диагностике чумного микроба и внесут вклад в исследование преобразований генома в процессе микроэволюции этого высоковирулентного биовара.

Translated abstract

We performed a comparative analysis of the phenotypic and genotypic characteristics of strains of the plague pathogen of phylogroups 2.MED4 and 2.MED1 of the medieval biovar of the main subspecies from epidemically active plague foci in the Caspian Sea region in the XX century. According to the results of the analysis, biochemical properties, nutritional requirements and plasmid profile of strains of phylogroups 2.MED4 and 2.MED1 of the medieval biovar of Y. pestis were determined. Genetic variability in the hemS, caf1M, and ssaJ genes associated with the virulence in strains of the 2.MED lineage was revealed. The data obtained on the phenotypic and genotypic characteristics of the medieval biovar of the plague microbe can be used in laboratory diagnostics of the plague microbe and will contribute to the study of genome changing in the process of microevolution of this highly virulent biovar.

Main article text

ВВЕДЕНИЕ

Чума – зоонозная природно-очаговая особо опасная инфекционная болезнь, этиологическим агентом которой является грамотрицательная бактерия Yersinia pestis. Чума оставила беспрецедентный след в истории всего человечества, и тысячелетия спустя она попрежнему сохраняет свой пандемический потенциал и способна привести к чрезвычайным ситуациям в области здравоохранения. Вид Y. pestis включает несколько основных филогенетических линий, одна из которых – 2.MED (средневековый биовар) – является возбудителем в очагах чумы в Российской Федерации и сопредельных государствах на общей площади 1959965 км² [1, 2]. Для штаммов этого биовара характерна экологическая пластичность, его популяции существуют в очагах различного типа: пустынных, полупустынных, горных, высокогорных, равнинных, в том числе и с высокой степенью аридизации, в которых не циркулируют другие биовары и подвиды Y. pestis [1-5]. Согласно историческим данным, наибольшую активность в XX веке Y. pestis проявила в очагах Прикаспийского региона, где в первой половине этого века произошли вспышки чумы с высоким процентом летальности [5]. Методами полногеномного SNP-анализа и филогенетической реконструкции 38 штаммов Y. pestis средневекового биовара нами установлено, что этиологическими агентами этих вспышек чумы в северной части Прикаспия были штаммы Y. pestis средневекового биовара филогрупп 2.MED1 и ранее не известной филогруппы 2.MED4 [3, 4]. При сравнении корового генома (от англ. core) выявлены отличия по SNP-профилю: 2.MED1 содержит 14 SNPs, а 2.MED4 – 9 SNPs. Уникальные полиморфизмы корового генома, отличающие новую филогруппу, находятся в генах, кодирующих биохимические процессы. Целью нашего исследования было проведение сравнительного анализа фено-и генотипических свойств штаммов Y. pestis филогрупп 2.MED1 и 2. MED4, вызвавших крупные вспышки чумы в Северном Прикаспии в первой половине XX века.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследовано 85 штаммов Y. pestis филогрупп 2.MED1 и 2.MED4 из природных очагов чумы Прикаспия, выделенных в 1912-2015 гг. от носителей, переносчиков, человека. Из них 18 штаммов (1917-50 гг.) относились к филогруппе 2.MED4. Географическое распространение и источник изоляции изученных штаммов показаны на Рис. 1.

Рис. 1.

Географическое распространение и источник изоляции изученных штаммов Y. pestis филогрупп 2.MED1 и 2.MED4. Номера очагов чумы соответствуют принятой в РФ классификации [5].

Культивирование штаммов осуществлялось на агаре или бульоне LB (pH 7.2) при температуре 28℃ или 37℃ в течение 24-48 ч. Для определения ферментативной активности использовали набор жидких сред Гисса и коммерческие стрипы АРI 20E (Bio Merieux, Франция). Для определения денитрифицирующей активности в 5 мл бульона LB с 0.1% азотнокислого калия (KNO₃) засевали 10⁸ КОЕ/мл Y. pestis и культивировали в течение 72 ч при 28℃. Учет осуществлялся после добавления 0.5 мл реактива Грисса: среда, содержащая штамм с денитрифицирующей активностью, приобретала малиновый цвет. Штаммы средневекового биовара не способны к восстановлению нитратов [6].

Определение питательных потребностей штаммов проводили по способу, предложенному R. Brubaker [7], с некоторыми изменениями [8]. Визуализацию результатов по установлению питательных потребностей штаммов Y. pestis из очагов Прикаспия в виде тепловой карты (heatmap) матрицы корреляции выполняли с помощью библиотеки seaborn v0.11.2.

Проверку способности штаммов образовывать пигментированные колонии проводили в трех параллельных посевах на среде LB c добавлением красителя Конго красного. Взвесь суточной культуры с концентрацией 5х10³ КОЕ/мл (0.1 мл) распределяли по поверхности агаровой пластины, инкубировали при 28℃ в течение суток с последующим выдерживанием в течение 2-10 суток при температуре 4℃. Учет результа-тов проводили по наличию выросших пигментирован-ных колоний, наличие бесцветных колоний означало отсутствие или неактивность области пигментации [6].

Для проверки зависимости роста штаммов чумного микроба от присутствия в среде ионов кальция использовали среду Higuchi & Smith (магниево-ок-салатный агар). Из каждого разведения взвеси суточной культуры (1х10³, 1х10⁴ и 5х10⁵ КОЕ/мл) вы-севали 0.1 мл на плотную питательную среду. Учет выросших Ca²⁺-независимых колоний проводили че-рез 48 ч инкубации при 37℃. Последующий учет Ca²⁺зависимых колоний осуществляли после инкубации при 28℃ в течение суток. В качестве контрольного образца для определения признака пигментации и Ca²⁺-зависимости использовался Y. pestis ЕV НИИЭГ [6]. Плазмидный профиль штаммов Y. рestis определяли по методике Каdo и Liu [9]. Сравнение 78 генов жизнеобеспечения и вирулентности штаммов Y. pestis филогрупп 2.MED4 и 2.MED1 проводили, выравнивая участки генов на референсную последовательность Y. pestis CO92 (номер доступа в GenBank NC_003143.1) с помощью программы MEGA X, exonerate [10] и алгоритма BLAST. Полногеномные последовательности исследованных геномов были депонированы нами ранее в NCBI GenBank [1, 3, 4].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Биохимические свойства, питательные потребности, пигментсорбция и зависимость от ионов Са²⁺

В этой работе исследованы штаммы Y. pestis основного подвида, выделенные за период 19122015 гг. от носителей, переносчиков и человека в 8 очагах чумы Прикаспийского региона: Прика-спийском Северо-Западном степном (25 шт.), Вол-го-Уральском степном (21 шт.), Волго-Уральском песчаном (20 шт.), Урало-Уильском степном (5 шт.), Урало-Эмбенском пустынном (3 шт.), Предустюртском пустынном (2 шт.), Прикаспийском песчаном (7 шт.), Зангезуро-Карабахском горном (2 шт.). По биохимическим свойствам все изученные штаммы имели типичный фенотип средневекового биовара: денитрификация^–, ферментация глицерина⁺, рамнозы^–, арабинозы⁺. При использовании АРI 20E теста установлено, что у 18% исследованных штаммов Y. pestis наблюдалось на-личие β-галактозидазной активности (расщепление субстрата ONPG – орто-нитрофенил-β-галактозида – с высвобождением о-нитрофенола и галактозы). Также у 5% штаммов отмечена способность к ферментации амигдалина (гликозида, AMY). Такие штаммы были выделены на территории Прикаспийского Се-веро-Западного степного (11 шт.), Волго-Уральского степного (4 шт.), Волго-Уральского песчаного (2 шт.) и Зангезуро-Карабахского горного (2 шт.) очагов чумы. По результатам анализа питательных потребностей 85 штаммов Y. pestis из Прикаспийского региона установлено, что независимо от географического района они имели идентичные питательные потребности по фенилаланину, метионину и треонину (рис. 1A, Б). У большинства штаммов из очагов чумы Прикаспия присутствует также ауксотрофность по цистеину, только 9% от исследованной выборки в нем не нуждались. У ряда штаммов из очагов Прикаспия обнаружена потребность в лейцине (9 шт.), что согласуется с результатами других работ [7]. У штаммов первой половины ХХ века выявлены потребности в аргинине (4 шт.) и серине (3 шт.). Различий в питательных потребностях у штаммов филогрупп 2.MED1 и 2.MED4 не установлено. Генетические причины ауксотрофности по аргинину, серину и лейцину у ряда штаммов 2.MED1 и 2.MED4 первой половины ХХ века предстоит выяснить в дальнейшем. Визуализацию результатов по определению питательных потребностей штаммов Y. pestis из очагов Прикаспия в виде матрицы корреляции (тепловой карты, heatmap) проводили с помощью библиотеки seaborn v0.11.2, основанной на matplotlib, в python 3.9.0. (рис. 2А, Б). Подсчет частоты встречаемости питательной потреб-ности по каждой аминокислоте осуществляли по каж-дому исследованному очагу (рис. 1Б).

Рис. 2.

Анализ питательных потребностей штаммов Yersinia pestis из очагов чумы Прикаспия. A. Матрица корреляции по питательным потребностям штаммов Y. pestis из очагов Прикаспия в виде тепловой карты (heatmap), построенная с помощью библиотеки seaborn v0.11.2, основанной на matplotlib, в python 3.9.0. Слева от матрицы по вертикали указаны штаммы возбудителя чумы, снизу по горизонтали – символы использованных аминокислот. Nic – никотинамид. Б. Матрица частоты встречаемости питательной потребности по каждой аминокислоте в природных очагах чумы.

По результатам проведенных анализов установлено, что штаммы филогрупп 2.MED4 и 2.MED1 имеют близкий профиль биохимической активности, что свидетельствует о фенотипической близости этих популяций, связанной с адаптацией к одинаковым ландшафтным, экологическим и фаунистическим ус-ловиям в природных очагах чумы.

У всех 85 исследованных штаммов Y. pestis были изучены признаки, ассоциируемые с вирулентностью возбудителя чумы, – пигментсорбция и зависимость роста от присутствия в среде ионов Ca²⁺. Утрата этих признаков приводит к аттенуации штаммов чумного микроба. Анализ наличия способности у штаммов Y. pestis поглощать пигмент на среде LB c добавлением Конго красного показал, что у ряда штаммов отсутствовала способность к сорбции красителя, что проявлялось в их росте в виде колоний белого цвета. Пигментированные колонии отсутствовали у 8 штаммов, у 24 штаммов отмечена гетерогенность по этому при-знаку (80-90% Рgm⁺; 60-70% Рgm^–). Потеря pgm области (102 т.п.н.), ответственной за проявление этого признака, у части изученных штаммов ранних годов выделения могла произойти вследствие ее нестабильности (гомологичной рекомбинации между двумя копиями фланкирующих элементов IS100). Анализ зависимости роста штаммов Y. pestis от присутствия ионов Са²⁺ на среде Higuchi & Smith при 37℃ показал, что 2 штамма Y. pestis средневекового биовара филогруппы 2.MED1 первой половины ХХ века не имеют этой зависимости, что свидетельствует о возможной утрате детерминанты вирулентности – плазмиды Са²⁺-зависимости pCD1.

Плазмидный скрининг штаммов Y. рestis филогрупп 2.MED4 и 2.MED1

Для возбудителя чумы, помимо кольцевой хромосомной ДНК, характерно наличие трёх резидентных плазмид. Родоспецифической является плазмида Са²⁺-зависимости pCD1. У Y. pestis также есть видоспецифические плазмиды: pMT1 – фракционная и pPCP1 – плазмида пестициногенности. Все три плазмиды содержат гены вирулентности, необходимые для реализации инфекционного процесса или трансмиссивной передачи чумы с помощью блох. По результатам скрининга выявлено, что у 16 штаммов первой половины ХХ века отсутствует плазмида пестициногенности pPCP1. Это могло произойти вследствие длительного хранения без лиофилизации. Штаммы были изолированы из разных источников на территории Прикаспийского Северо-Западного степного (5), Волго-Уральского степного (4) и Волго-Уральского песчаного (7) очагов чумы. Плазмиды Са²⁺-зависимости pCD1 лишены 2 штамма Y. pestis 2.MED1 средневекового биовара первой половины ХХ века, что коррелирует с полученными результатами анализа зависимости роста при 37℃ на среде Higuchi&Smith от присутствия ионов Са²⁺. Плазмида pCD1 кодирует гены, которые участвуют в механизмах проявления вирулентности чумного микроба, при ее потере штамм становится авирулентным. Остальные изученные штаммы возбудителя чумы средневекового биовара обладали всеми тремя плазмидами и являлись вирулентными.

Изучение генетических детерминант вирулентности и «домашнего хозяйства» штаммов Y. pestis филогруппы 2.MED4 в сравнении с другими штаммами средневекового биовара

Нами проведен сравнительный анализ 78 генов вирулентности и «домашнего хозяйства» у штаммов Y. pestis филогруппы 2.MED4 и штаммов других ветвей средневекового биовара, полногеномные последовательности которых были депонированы нами ранее в базе данных NCBI GenBank [1, 3, 4]. С помощью программ MEGA X, exonerate и алгоритма BLAST были проанализированы гены, кодируемые хромосомой (43 гена) и тремя плазмидами возбудителя чумы: pMT1 (3 гена), pCD1 (29 генов), pPCP1 (3 гена). Гены, расположенные на хромосоме, вовлечены в механизмы проявления вирулентности, энергетического обмена, мембранного транспорта и борьбы за выживание в условиях дефицита питательных веществ: это гены хромосомной области пигментации, адгензины – pH6 антиген и Ail белок, различные ферменты, белки-транспортеры, мембранные белки и ре-гуляторы транскрипции. В хромосомном гене hemS, кодирующем гемодеградирующий фактор, найдена синонимичная замена (111, C → T). Данная замена присутствует у всех филогенетических ветвей средневекового биовара (Таблица 1).

Таблица 1.

Выявленные SNPs у штаммов Y. pestis средневекового биовара

Расположение гена	Ген, тип SNP, замены а	Кодируемый продукт	Филогенетическая принадлежность
Хромосома	hemS 111, C → T синонимичная	Гемодеградирующий фактор	Специфична для 2.MED
pMT1	caf1M 29, G → A несинонимичная Глицин G → Глутаминовая к-та E	Периплазматический шаперон (в составе оперона капсульного антигена F1)	Специфична для 2.MED4
pCD1	ssaJ инсерция С (272)	Белок аппарата секреции III типа, семейство YscD / HrpQ	Специфична для 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED4

а

замены указаны относительно позиции в гене референсного штамма Y. pestis СО92 (AL590842.1).

По результатам сравнительного анализа последо-вательности нуклеотидов генов caf1AM (ген капсулообразования) и ymt («мышиный» токсин), кодируемых плазмидой pMT1, выявлена несинонимичная замена (G → A, 29; nsSNP: G→ E, 10) в нуклеотидной последовательности гена caf1M периплазматического шаперона (в составе оперона caf1 капсулообразования) у штаммов 2.MED4 по сравнению с 2.MED1 и другими филогенетическими ветвями Y. pestis. Замена находится в 10-й аминокислоте белковой последовательности и, по всей видимости, не нарушает функциональной активности белка, что было подтверждено иммунохроматографическим тестом на наличие капсульного антигена F1 (производство Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск). Из генов, расположенных на плазмиде pCD1, было проанализировано 29 генов, кодирующих вирулон Yop (yopEHJKMT, ypkA), компоненты системы секреции III типа (yscBCDEFGKLOPQRSTUYVX, ssaJ, lcrRO), V антиген (lcrV). В гене ssaJ плазмиды pCD1, кодирующем белок аппарата секреции III типа семейства YscD / HrpQ, найдена инсерция цитозина (С) в 272 положении. Данная инсерция привела к мутации сдвига рамки считывания (от англ. frameshift) и наруше-нию функции гена. Поскольку аппарат Ysc состоит из 25 белков, вполне вероятно, что выполнение функции гена ssaJ могли взять на себя другие белки этого комплекса. Мутация специфична для средневекового биовара ветвей 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED4, но не 2.MED0 (Таблица 1). В генах активатора плазминогена (рla), пестицина (pst), белка иммунности к пестицину (pim), расположенных на плазмиде pPCP1, вариабельности у штаммов средневекового биовара обнаружено не было. Исследованные гены вирулентности и «домашнего хозяйства» показали высокую степень консервативности, что объясняется важностью их продуктов для процесса патогенеза и обеспечения жизнедеятельности, а также эволюционной молодостью средневекового биовара чумного микроба.

Таким образом, в этой работе выполнен анализ фенотипических и генотипических характеристик штаммов Y. pestis средневекового биовара филогрупп 2.MED1 и 2.MED4, которые являлись этиологическими агентами вспышек чумы в начале ХХ века в Прикаспии, для определения их феногенетического портрета. По результатам комплексного исследования биохимических свойств и питательных потребностей 85 штаммов Y. pestis из очагов Прикаспия значимых отличий на фенотипическом уровне между штаммами 2.MED4 и 2.MED1 обнаружено не было. Выявлено, что все изученные штаммы 2.MED4 и 2.MED1 из этих при-родных очагов проявляют питательную потребность в метионине, фенилаланине и треонине. Большинство штаммов из исследованной выборки нуждались в ци-стеине, только у 9% штаммов эта потребность отсут-ствовала. Установлены дополнительные потребности штаммов Y. pestis из Прикаспийского региона первой половины ХХ века в R (аргинин) – 4 шт. – и S (серин) – 3 шт. У некоторых штаммов первой половины ХХ века отсутствуют плазмиды пестициногенности pPCP1 и Ca²⁺-зависимости pMT1. При проверке свойства пигментсорбции установлено, что у ряда штаммов отсутствует хромосомная область пигментации.При анализе 78 генов, ассоциированных с вирулентностью, и генов жизнеобеспечения получены новые данные по генетической изменчивости гена hemS гемодеградирующего фактора у штаммов средневекового биовара, гена caf1М периплазматического шаперона в составе опе-рона синтеза фактора вирулентности-белковой капсулы F1 у филогруппы 2.MED4 чумного микроба и генa ssaJ аппарата секреции III типа из семейства YscD / HrpQ у штаммов филогенетических ветвей 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED4 средневекового биовара.

Отсутствие значимых фенотипических различий в дифференциальных биохимических свойствах между филогруппами 2.MED4 и 2.MED1 можно объяснить коротким периодом их дивергенции, а также одинаковыми условиями существования в природных экосистемах Прикаспийского региона. Согласно полученным нами результатам в этой и других работах, а также данным эпизоотологического мониторинга, можно предположить симпатрический сценарий образования этих популяций средневекового биовара [3-5]. Последствия обнаруженных однонуклеотидных замен в генах вирулентности и жизнеобеспечения, обусловивших дивергенцию этих филогрупп, еще предстоит выявить. Дальнейшее исследование фенотипических и генотипических особенностей штаммов средневекового биовара Y. pestis позволит определить генетические основы причин ауксотрофности и особенностей биохимического профиля этого биовара, что может быть использовано в лабораторной диагностике чумного микроба, а также для характеристики родственных отношений этих высоковирулентных популяций Y. pestis в современный период.

Footnotes

Конфликт интересов: Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

Финансирование: Исследование выполнено в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ

1. Kutyrev VV, Eroshenko GA, Motin VL, Nosov NY, Krasnov JM, Kukleva LM et al. Phylogeny and classi-fication of Yersinia pestis through the lens of strains from the plague foci of Commonwealth of Independent States. Front Microbiol 2018; 9(1106), 1-11. doi: 10.3389/fmicb.2018.01106.

2. Попов НВ, Ерошенко ГА, Карнаухов ИГ, Кузне-цов АА, Матросов АН, Иванова АВ и др. Эпидеми-ологическая ситуация по чуме в 2020 г. Прогноз эпизоотической активности природных очагов чумы Российской Федерации и других стран СНГ на 2021 г. Проблемы особо опасных инфекций 2021; 1, 52-62. doi: 10.21055/0370-1069-2021-152-62.

3. Eroshenko GA, Popov NV, Al’khova ZV, Kukleva LM, Balykova AN, Chervyakova NS et al. Evolution and circulation of Yersinia pestis in the Northern Caspian and Northern Aral Sea regions in the 20^th-21^st centuries. PLoS ONE 2021; 16(2), e0244615. doi: 10.1371/journal.pone.0244615.

4. Balykova AN, Kukleva LM, Naryshkina EA, Eroshenko GA, Kutyrev VV. Five Draft Genome Sequences of Historical Yersinia pestis Strains of Phylogroups 2.MED4 and 2.MED1 of the Medieval Biovar. Microbiol Resour Announc 2022; 11(5), e0004422. doi: 10.1128/mra.00044-22.

5. Кадастр эпидемических и эпизоотических проявлений чумы на территории Российской Федерации и стран ближнего зарубежья (с 1876 по 2016 год). Под ред. акад. РАМН В. В. Кутырева и проф. А. Ю. Поповой. Саратов: ООО «Амирит», 2016. 248 с.

6. Онищенко ГГ, Кутырев ВВ. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практи-ческое руководство. Изд. 2-е перераб. и доп. М.: ЗАО «Шико», 2013. 560 с.

7. Brubaker R. Interconversion of Purine Mononucleotides in Pasteurella pestis. Infect Immun 1970; 1(5), 446-54. doi: 10.1128/iai.1.5.446-454.1970.

8. Куклева ЛМ, Одиноков ГН, Шавина НЮ, Ерошенко ГА, Кутырев ВВ. Сравнительный анализ пита-тельных потребностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов и генетические причины их ауксотрофности. Проблемы особо опасных инфекций 2013; 2, 33-6. doi: 10.21055/0370-1069-2013-2-33-36.

9. Kado С, Liu ST. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol 1981; 145(3), 1365-73. doi: 10.1128/jb.145.3.1365-1373.1981.

10. Slater GS, Birney E. Automated generation of heuristics for biological sequence comparison. BMC Bioin-formatics 2005; 6, 31. doi: 10.1186/1471-2105-6-31.