miR-15a/16在多发性骨髓瘤患者中的表达研究 Translated title: Dysfunction of miR-15a/16 in multiple myeloma

Abstract

染色体异常和血管生成在多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）发病中占有重要地位[1]。13q14缺失是MM患者最常见的染色体异常，miR-15a/16即定位于该染色体上。血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor, VEGF-A）在MM的发病中具有诱导新生血管形成、诱导骨髓瘤细胞增殖和迁移、增加破骨细胞活性和调节免疫细胞活性等多种功能。在对骨肉瘤及神经胶质瘤的研究中也证实了miRNA对VEGF-A的调控作用[2]–[3]，然而在MM中关于miRNA是否可以调节VEGF-A表达的研究仍较少。本研究中我们拟分析MM患者miR-15a/16、VEGF-A的表达情况；并通过细胞模型进一步研究miR-15a/16对VEGF-A的调控作用，从而为靶向miR-15a/16及抗血管生成治疗MM提供新的依据。 病例与方法 1．病例资料及细胞株来源：病例为2013年11月至2015年2月我院收治的45例初诊MM患者，男25例，女20例，中位年龄62岁，其中IgG型22例，IgA型10例，轻链型12例，不分泌型1例。所有患者均符合国际骨髓瘤工作组（IMWG）诊疗标准[4]。对照组为15名健康体检者，其中男9名，女6名，中位年龄56岁。本研究获得我院伦理委员会批准，所有患者及对照者均签署知情同意书。骨髓瘤细胞株U266细胞由本实验室冻存。 2．骨髓单个核细胞的收集：采集患者及对照者EDTA抗凝骨髓5 ml，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离单个核细胞和骨髓上清，冻存于−80 °C冰箱备用。 3．荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测miR-15a/16、VEGF-A mRNA表达水平：采用TRIzol法提取单个核细胞总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检验RNA质量后反转录成cDNA（TRIzol试剂盒和M-MLV反转录酶购自美国Invitrogen公司）。qRT-PCR试剂盒购自瑞士Roche公司。引物序列：GAPDH：上游：5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游：5′-CAAAGGTGGAGGAGTGGGTG-3′；VEGF-A：上游：5′-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3′，下游：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′；miR-15a：上游：5′-GCGGCGGTAGCAGCACATAATG-3′，下游：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；miR-16：上游：5′-GCGGCGGTAGCAGCACGTAAAT-3′，下游：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；U6：上游：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应条件：95 °C 10 min，95 °C 15 s，60 °C 1 min，40个循环。扩增完成后作熔解曲线验证产物的特异性，采用2−ΔΔCt法计算miR-15a/16、VEGF-A mRNA相对表达水平。 4．ELISA法检测VEGF-A表达水平：ELISA试剂盒购自上海富勒生物科技有限公司，按照说明书进行操作。 5．慢病毒感染U266细胞：U266细胞常规培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37 °C、5%CO2培养箱常规传代培养。取对数生长期细胞用于实验。绿色荧光蛋白（GFP）标记的过表达miR-15a/16以及空载体（con）慢病毒由上海吉凯公司包装完成。感染前1 d U266细胞换液，每孔接种4×105个细胞于96孔板中，每孔加终浓度为1 × 108 TU/ml的病毒10 µl, 10 mg/L聚凝胺10 µl，用RPMI 1640培养基补至总体积为100 µl，混匀后置于37 °C、5% CO2培养箱中培养。3 d后将细胞扩大培养，采用流式细胞术分选出GFP阳性细胞用于后续实验。 6．CCK-8法检测细胞增殖：实验分组：①U266细胞组；②U266-miR-15a组：转染过表达miR-15a慢病毒载体U266细胞组；③U266-miR-16组：转染过表达miR-16慢病毒载体U266细胞组；④U266-con组：转染空载体U266细胞组。分别取对数生长期细胞，每孔接种4×104个细胞于96孔板中，每孔终体积100 µl，置于37 °C、5%CO2培养箱中培养。于22、46、70 h时加CCK-8溶液（试剂盒购自日本同仁化学研究所），每孔5 µl，轻微振荡混匀，37 °C孵育2 h后采用自动酶标仪测定波长450 nm处的吸光度（A）值。结果以（A 处理组−A 空白组）/（A 未处理组−A 空白组）表示。每组设3复孔，实验重复3次。 7．流式细胞术检测细胞凋亡：实验分组同上。Annexin Ⅴ/7-AAD凋亡试剂盒购自美国eBioscience公司。每管取1×106个细胞，按试剂盒说明书进行孵育、洗涤后上流式细胞仪检测。每组设3复孔，实验重复3次。 8．Western blot法检测凋亡相关蛋白：实验分组同上。参照文献[5]方法进行操作，检测过表达miR-15a/16后抗凋亡蛋白Bcl-2的变化。 9．统计学处理：采用SPSS16.0软件对数据进行统计学分析。数据以 x ±s表示，两组间比较采用t检验或非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 结果 1．miR-15a/16、VEGF-A mRNA在MM患者中的表达：结果显示miR-15a/16在MM患者中的表达水平均较健康对照组低（P值分别为0.018和0.035），两组VEGF-A mRNA水平比较差异无统计学意义（P=0.387），MM患者骨髓上清中VEGF-A含量显著高于健康对照组（P=0.000）（表1）。 表1 多发性骨髓瘤患者中miR-15a/16、VEGF-A mRNA的表达（ x ±s） 组别 例数 miR-15a miR-16 VEGF-A mRNA VEGF-A（ng/L） 多发性骨髓瘤患者组 45 0.34±0.27 0.86±0.80 1.62±3.59 239.93±126.38 健康对照组 15 0.85±0.62 1.27±0.66 3.94±6.42 104.93±60.74 P值 0.018 0.035 0.387 0.000 注：VEGF：血管内皮生长因子 2．慢病毒感染U266细胞：病毒感染U266细胞72 h后，荧光显微镜下均可见到绿色荧光，显示慢病毒成功感染细胞。采用流式细胞术分选GFP阳性细胞，其阳性率达98％以上（图1）。 图1 荧光显微镜下观察转染过表达miR-15a慢病毒载体U266细胞（U266-miR-15a组） 3．过表达miR-15a/16对U266细胞VEGF-A表达水平、细胞凋亡及细胞增殖的影响：与U266-con组比较，过表达miR-15a/16后，U266细胞VEGF-A mRNA表达水平无明显变化（P值均>0.05），但细胞培养上清液中VEGF-A表达水平明显降低（P值均<0.05），细胞凋亡率增加（P值均<0.05）（表2）；抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降（图2）。与U266-con组相比，U266-miR-15a、U266-miR-16组细胞增殖受到抑制（P值均< 0.05），U266-con组与U266组比较差异无统计学意义（P> 0.05）（表2）。 表2 过表达miR-15a/16后对U266细胞VEGF-A表达水平、细胞凋亡及增殖的影响（ x ±s） 组别 VEGF-A mRNA VEGF-A（ng/L） 细胞凋亡率（%） 不同时间点细胞增殖（A值比值） 24 h 48 h 72 h U266细胞组 1.04±0.26 384.01±5.89 1.51±0.81 0.35±0.08 1.12±0.16 1.08±0.03 U266-con组 1.00 379.08±4.70 2.08±1.25 0.30±0.05 0.93±0.09 1.09±0.15 U266-miR-15a组 1.11±0.27 347.62±6.94a 2.98±0.95a 0.22±0.03a 0.76±0.15a 0.99±0.06a U266-miR-16组 1.16±0.49 346.44±5.72a 2.90±1.33a 0.19±0.03a 0.62±0.09a 0.99±0.07a 注：U266-con组：转染空载体U266细胞组；U266-miR-15a组：转染过表达miR-15a慢病毒载体U266细胞组；U266-miR-16组：转染过表达miR-16慢病毒载体U266细胞组；与U266-con组比较，a P<0.05。每组设3个复孔，实验重复3次 图2 Western blot法检查过表达miR-15a/16对U266细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平的影响 1：U266细胞组；2：转染空载体U266细胞组；3：转染过表达miR-15a慢病毒载体U266细胞组；4：转染过表达miR-16慢病毒载体U266细胞组 讨论 越来越多的研究表明miRNA在实体肿瘤以及包括MM在内的血液系统肿瘤中均存在表达失调[6]–[7]。miRNA通过靶向原癌基因或抑癌基因的表达调节肿瘤的发生、发展，可以作为疾病诊断、进展及预后的新型标志[8]–[9]。近来有研究表明miRNA表达还与肿瘤细胞的耐药相关[10]–[11]，使其成为肿瘤治疗的新靶点。 miR-15a/16是第一个被证明参与肿瘤发病的miRNA，定位于13q14上。研究证实在多种实体肿瘤、淋巴瘤、白血病及约50％的MM患者中都存在该染色体的缺失或miR-15a/16低表达[12]–[13]，但关于miR-15a/16对MM细胞株生物学行为的影响及其机制的报道并不多。在本研究中我们的结果显示，与健康对照组相比，MM患者miR-15a/16的表达水平降低，与Roccaro等[14]的研究结果一致，且我们的前期研究结果表明随着MM进展miR-15a/16的表达水平呈进行性下降[15]。同时，我们选取低表达miR-15a/16的骨髓瘤细胞株U266细胞为研究对象，应用慢病毒转染技术使U266细胞过表达miR-15a/16，探讨其对骨髓瘤细胞生长的影响。实验结果显示过表达miR-15a/16后，细胞增殖速度降低、凋亡增加，证实了miR-15a/16在MM发病中的抑癌基因作用。 Bcl-2是一种重要的抗凋亡基因，它通过抑制细胞膜超极化、调节caspase信号通路等机制促进细胞生存，抑制细胞凋亡。在本研究中我们发现过表达miR-15a/16后，U266细胞中Bcl-2的表达明显下调，说明miR-15a/16可能是通过抑制Bcl-2基因的表达实现促肿瘤细胞凋亡作用的。关于miR-15a/16在MM中是否参与其他信号通路调节及其机制还在进一步研究中。 血管新生在MM的发生、发展中发挥重要作用，而VEGF-A是目前已知最强的促血管生成因子[16]。MM细胞既可以直接分泌VEGF-A，也可以诱导骨髓基质细胞分泌VEGF-A[17]，进而促进血管内皮细胞增殖，诱导肿瘤新生血管生成，为MM细胞提供更适宜的生存环境，促进MM进展。在本研究中我们的结果显示MM患者VEGF-A的表达水平显著高于健康对照者，过表达miR-15a/16后，U266细胞VEGF-A分泌水平下降，而VEGF-A mRNA水平并无变化，这与Sun等[18]的研究结果一致，说明miR-15a/16对VEGF-A的调控作用发生在转录后水平。miR-15a/16通过下调VEGF-A的表达减少新生血管形成，制造不利于MM细胞生存的环境，至少在一定程度上可以延缓MM的发展过程。但本研究只是体外实验，关于其体内效应还在进一步研究中。 综上，通过研究我们验证了miR-15a/16在MM患者中存在低表达，更进一步证实了miR-15a/16不仅可以直接抑制MM细胞的生长，促进其凋亡，还可以通过降低骨髓微环境中VEGF-A的分泌水平，减少血管生成，间接调控MM进展，发挥抑癌基因作用。