Der Aktivierungsmechanismus von Rhodopsin

Abstract

Rhodopsin, der Rezeptor der visuellen Kaskade, gehört zu größten Klasse A der G-Protein-koppelnden Rezeptoren (GPCRs) und gilt als Modell-Rezeptor in der GPCR-Forschung. Über 3 % des humanen Genoms kodieren für GPCRs, doch trotz der physiologischen Bedeutung dieser Proteinfamilie sind die fundamentalen Mechanismen, mit denen diese Rezeptoren extrazelluläre Signale in das Zellinnere weiterleiten noch nicht verstanden. In der vorliegenden Dissertation werden Aspekte des Aktivierungsmechanismus von Rhodopsin sowie der Kopplung und Aktivierung des G-Proteins Transduzin untersucht. Die Arbeit ist in drei Schwerpunkte unterteilt: I. Es wurde ein in GPCR’s hochkonserviertes NPxxYx(5,6)F Motiv (Aminosäuresequenz Asn-Pro-x-x-Tyr-x(5,6)-Phe) in der siebten und achten Helix charakterisiert. In diesem konservierten Motiv sind mehrere für die Ausbildung der aktiven Rezeptorkonformation wichtige Funktionen vereint: Verknüpfung zu einem Wasserstoffbrückennetzwerk, Helixflexibilität sowie die exakte Positionierung der achten Helix. Letzteres hat nicht nur bei der Rezeptoraktivierung sondern auch bei der nachfolgenden Interaktion mit dem G-Protein eine Bedeutung. II. Anhand von chimären Rezeptoren, bei denen Teile der achten Helix durch homologe Sequenzen des beta2-adrenergen Rezeptors ausgetauscht wurden, wurde die Rolle der achten Helix bei der Rezeptor-Aktivierung und Bindung des G-Proteins untersucht. Auch bei dieser Studie wurde gezeigt, dass die exakte Positionierung der achten Helix essentiell für die Interaktion mit dem G-Protein ist. Zudem wurde ein bezüglich der G-Protein-Aktivierung funktionsfähiger chimärer Rezeptor gefunden, was auf einen übergeordneten Mechanismus bei der Aktivierung von G-Proteinen durch GPCRs hindeutet. III. Die Funktion des ß-Ionon-Rings des Retinals beim Aktivierungsmechanismus von Rhodopsin wurde an einem Retinal studiert, bei welchem Teile des Retinal-Rings fehlten (azyklisches Retinal). Auch diesem azyklischen Retinal können Eigenschaften eines partiellen Agonisten zugeschrieben werden. Beim Vergleich zu Pigmenten mit dem nativen 11-cis-Retinal wurden starke Analogien bei der initialen Energieaufnahme durch die Retinal-Isomerisierung sowie bei der Weiterleitung der Lichtenergie ins Protein gefunden. Allerdings wird die Energie schlechter auf das Protein übertragen, wodurch wesentlich weniger der aktiven G-Protein bindenden Rezeptorkonformation gebildet wird. Als wichtigste Funktion des Retinal-Rings wurde die Aufrechterhaltung der aktiven Meta-II-Konformation identifiziert.

Abstract

Rhodopsin, the receptor of the visual cascade, belongs to the largest group A of G-protein coupled receptors (GPCRs) and can be seen as a model receptor in GPCR research. More than 3 % of the human genome code for GPCRs. But despite their physiological relevance, the detailed mechanism of signal transduction from extra cellular signal to different cellular pathways remains to be fully understood. Different aspects of receptor activation and the coupling and activation of the G-protein transducin are investigated in this dissertation. The thesis focuses on the following three subjects: I. A NPxxYx(5,6)F motif (amino acid sequence Asn-Pro-x-x-Tyr-x(5,6)-Phe) has been characterized for rhodopsin. It is localized in helix VII and VIII and is highly conserved throughout the GPCR family. Various roles for rhodopsin activation are combined in this motif: linkage to a hydrogen-bond network, helix flexibility and the exact positioning of helix VIII. The latter is not only relevant for the activation of the receptor but also for interaction with its G-protein. II. The role of helix VIII for receptor activation and G-protein coupling was studied on chimeric receptors, in which parts of helix VIII were exchanged against homologous sequences of the beta2 adrenergic receptor. This study confirmed the importance of helix VIII’s position for G-protein coupling. Furthermore, a chimeric receptor was found, which was fully functional concerning G-protein activation. This indicates that GPCRs might use a single, generic mechanism for G-protein activation. III. The role of the ß-ionone-ring for the activation mechanism of rhodopsin was studied by means of an acyclic retinal, which lacks four carbon atoms of the ß-ionone-ring. This modified retinal could be classified as a partial agonist for rhodopsin. Energy input by retinal isomerization and formation of the G-protein binding Meta-II conformation were found to be very similar to rhodopsin when bound to its native 11-cis-retinal. However, the lack of the ring structure resulted in a lower amount of Meta-II and a fast decay of activity. It was concluded that the main role of the ring structure is to maintain the active state of rhodopsin.