Uso da técnica de Southern Blot/Hibridização associada à reação em cadeia da polimerase para aumentar a sensibilidade no diagnóstico das infecções por hemoplasmas em gatos domésticos: Use of Southern Blot/Hybridization technique associated to polymerase chain reaction to improve the sensitivity in the diagnosis of hemoplasma infections in domestic cats

Abstract

O objetivo deste trabalho foi verificar se a técnica de Southern Blot/Hibridização (SB) em associação à reação de polimerização em cadeia (PCR) aumenta a sensibilidade na detecção de DNA de hemoplasmas em gatos domésticos (Felis catus). O sangue total foi coletado em tubos contendo o anticoagulante ácido etilenodiamino tetra-acético, o DNA extraído a partir de 149 animais e a PCR realizada com o uso de sequências iniciadoras espécie-específicas, para amplificar subunidade 16S do RNA ribossomal de Mycoplasma haemofelis e 'Candidatus M. haemominutum' dessas amostras. Para a hibridização, foram utilizadas sondas específicas quimicamente marcadas, e os resultados visualizados por meio da adição de substrato quimiluminescente seguida de autoradiografia. Dezoito (12,1%) das 149 amostras testadas apresentaram resultado PCR-positivo para o DNA de hemoplasmas. A técnica de SB mostrou que 24/149 (16,1%) amostras apresentaram resultado positivo para hemoplasmas, confirmando os 18 resultados PCR-positivos, além de revelar seis outros adicionais (p < 0,001). O método de SB com sondas específicas mostrou-se mais sensível do que a PCR realizada isoladamente, sendo complementar para o diagnóstico das infecções causadas pelos hemoplasmas felinos.

Translated abstract

The aim of this study was to determine whether Southern Blot/Hybridization (SB) associated to Polymerase Chain Reaction (PCR) improves the sensitivity in the detection of hemoplasma DNA in domestic cats (Felis catus). Whole blood was collected in tubes containing the anticoagulant ethylenediamine tetra-acetic acid and DNA extracted from 149 animals. PCR was performed using species specific primers to amplify the 16S ribosomal RNA subunit of Mycoplasma haemofelis and 'Candidatus M. haemominutum' from these samples. Hybridization was performed using a 16S rDNA probes chemically labeled and the results were visualized using a chemiluminescent substrate addition followed by autoradiography. Eighteen (12.1%) of the 149 tested samples had a positive PCR result for hemoplasma species DNA. SB/hybridization technique showed that 24/149 (16.1%) samples were positive for hemoplasmas, confirming the 18 PCR-positive results and reveling six additional positive animals (p < 0.001). SB/hybridization method with specific probes was more sensitive than PCR performed alone, being complimentary to this technique to diagnose infections caused by feline hemoplasmas.