Грипп лошадей – остро протекающая контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся катаральным воспалением органов респираторного тракта, общим угнетением, кратковременной лихорадкой и сухим болезненным кашлем, а в тяжелых случаях – разви-тием пневмонии. Среди известных подтипов вируса гриппа лошадей (ВГЛ) Н7N7 и Н3N8 наиболее распространенным считается Н3N8, который представляет серьезную угрозу для здоровья лошадей, а также экономическую проблему для коневодства [1]. В настоящее время наиболее эффективным способом борь-бы против этой инфекции является специфическая профилактика, которая осуществляется с помощью инактивированных и живых вакцин.
Инактивированные вакцины, содержащие целые вирусные частицы или их субъединицы, начиная с 1960-х годов были широко внедрены в ветеринарную практику. Главное достоинство данного типа вакцин заключается в их безопасности вследствие отсутствия вирусной репликации [2]. При этом наиболее значимыми недостатками инактивированных вакцин являются слабая иммуногенность, обусловленная формированием исключительно гуморального иммунного ответа, а также непродолжительный иммунитет, вызывающий необходимость многократного введения препарата [3, 4, 5]. Например, для формирования у лошадей гуморального иммунитета продолжительностью 12 месяцев требуется трехкратная иммунизация инактивированными вакцинами (первые две – с интервалом в 4-6 недель и третья – на 5-6 месяце) [3, 4, 5], поскольку сформированные при этом противовирусные IgG(T) антитела являются ко-роткоживущими (не более 100 дней после вакцинации) [6]. Критичным в подобной схеме иммунизации является еще и то, что между вторым и третьим введением инактивированных вакцин лошади наиболее уязвимы и в полевых условиях могут быть инфицированы вирусом гриппа [7]. К тому же некоторые инактивированные вакцины с адъювантами (фосфат или гидроокись алюминия) вызывают у привитых (внутримышечно) животных нежелательные явления, которые преимущественно характеризуются воспалительными реакциями и болевыми ощущениями в месте введения препарата [8]. Подобная реакция связана еще и с тем, что для накопления вакцинных вирусов в технологическом процессе производства инактивированных вакцин традиционно используются куриные эмбрионы, и даже после очистки вируса в составе вакцины, как правило, остается значительное количество яичного белка, который при многократном внутримышечном введении может оказывать реактогенное действие [2].
На фоне перечисленных недостатков инактивированных вакцин против гриппа лошадей наиболее обнадеживающие результаты, особенно в плане эффективности, демонстрируют живые аттенуированные вакцины. Среди них особое место занимают препараты, приготовленные на основе холодоадаптированных (ca) штаммов. Суть данного типа вакцины заключается в том, что са штаммы ВГЛ, обладая способностью эффективно репродуцироваться в верхних дыхательных путях, не размножаются при повышенной температуре нижних дыхательных путей, где репликация дикого вируса обычно сопровождается развитием воспалительных процессов (бронхит, пневмония) [9]. Подобным образом у привитых лошадей воспроизводится легкая форма естественной гриппозной инфекции, которая в дальнейшем приводит к образованию противовирусного гуморального и клеточного иммунного ответов. Кроме того, вакцина из са штамма, в отличие от инактивированных препаратов, способна формировать у привитых животных перекрестно реагирующий Т-клеточный иммунитет, что весьма важно в связи с антигенной изменчивостью (антигеный дрейф) вирусов гриппа лошадей [10]. Описанный подход к созданию живой вакцины против гриппа лошадей из са штамма впервые с успехом применен в США. С 1999 года в этой стране лицензирована и широко применяется живая са модифицированная вакцина (Flu Avert® I.N., Heska Corporation), вводимая интраназально [11]. В своем составе эта вакцина содержит са штамм A/equine/Kentucky/1991 (H3N8) североамериканского происхождения, но она также может обеспечивать защиту от ВГЛ подтипа H3N8 европейской линии. Несмотря на то, что вакцина Flu Avert® не стимулирует высокий уровень гуморального ответа, однократное введение этой вакцины вызывает более продолжительную защиту от инфекции (не менее 6 месяцев), чем инактивированные вакцины. Кроме того, у животных, привитых этой вакциной, образуются имму-ноглобулины класса А, так называемые секреторные антитела, способные нейтрализовать болезнетворный агент в самой ранней стадии развития инфекционного процесса в верхних дыхательных путях [9]. Однако при всех преимуществах данного типа вакцин существуют некоторые опасения относительно их безопасности, что связано с риском возможной реверсии вакцинного вируса или его реассортацией с циркулирующим вирусом дикого типа в организме лошади с последующим появлением новых патогенных вирусов [2]. Хотя указанные опасения имеют под собой основу, все же более чем 20-летний положительный практический опыт применения живой интраназальной аттенуированной гриппозной вакцины у людей в России, а с недавних пор и в странах Северной Америки и Западной Европы (FluMist®), исключает подобную вероятность [2]. Что же касается вакцинных са штаммов ВГЛ, то здесь отсутствие случаев реверсии или реассортации объясняется следующим образом. Экспериментально подтверждено, что са штаммы ВГЛ способны не только проявлять стабильность фенотипа температурочувствительности (ts) in vivo на протяжении пяти последовательных пассажей от лошади к лошади, но также подавлять репликацию вируса дикого типа в верхних дыхательных путях лошадей [10]. Интересно, что са вакцина против ВГЛ может быть использована для терапии гриппозной инфекции у лошадей [11, 12].
Еще одним профилактическим препаратом, нашедшим применение на практике (впервые лицензирован в странах Европейского Союза в 2003 году), является живая вакцина на основе рекомбинантного вируса оспы канарейки (canarypox) (ProtegFlu, Merial Ltd., Великобритания) [2]. Данная вакцина включает два вирусных вектора на основе вируса canarypox, кодирующих гемагглютинины (НА) ВГЛ штаммов A/equine/Newmarket/2/93 (H3N8) (европейская ли-ния) и A/equine/Kentucky/94 (H3N8) (американская линия). В отличие от инактивированных вакцин она способна формировать у привитых лошадей как гуморальный (включая секреторные IgA антитела), так и клеточный иммунные ответы [13, 14]. Однако, как и в случае инактивированных вакцин, для формирования у лошадей протективного иммунного ответа продолжительностью 12 месяцев необходимо трехкратное введение этой вакцины (первые два – с интервалом в 35 дней и третье – на 6-м месяце) [15]. Более того, ввиду наличия в составе этой вакцины адъюванта Carbormer 974P, она нередко приводит к местным нежелательным явлениям у привитых лошадей [16, 17]. Наиболее критичным в отношении данного типа вакцины является то, что у привитых животных уже после первой вакцинации образуется напряженный иммунитет к используемым вирусным векторам, который при повторном введении тех же вирусных векторов препятствует их репродукции и, следовательно, экспрессии чужеродных белков [2, 17, 18]. Для преодоления данного барьера по отношению к векторным вакцинам против гриппа лошадей Breathnach et al. [19] успешно применили перекрестную схему иммунизации. Суть данной схемы заключалась в том, что первичная вакцинация лошадей проводилась ДНК-вакциной, кодирующей НА и нуклеопротеидный белок от штамма A/equine/ Kentucky/1/81 (H3N8), а последующая вакцинация (на 6-й и 10-й неделе) – модифицированным вирусом vaccinia Ankara, кодирующим те же самые белки. Однако данная схема вакцинации, ввиду ее сложности и низкой производительности, не нашла применения на практике.
Таким образом, если не брать в расчет вакцины, которые пока находятся только на стадиях разработки или внедрения в практику (ДНК вакцины [20, 21], живые аттенуированные гриппозные вирусные вакцины, полученные методом обратной генетики [22, 23]), в настоящее время широкое практическое применение нашли лишь инактивированные, живые са и векторные вакцины против гриппа лошадей. Поэтому при решении задачи по созданию безопасной и эффективной вакцины против ВГЛ подтипа Н3N8 в Казахстане, где в 2007 году была зарегистрирована крупная вспышка этой болезни (заболело около 200 тысяч лошадей, из них пало 50 тысяч, в том числе 40 тысяч молодняка [24]), мы делали выбор из вышеперечисленных препаратов. При дальнейшем детальном анализе преимуществ и недостатков указанных вакцин мы пришли к выводу, что с точки зрения баланса между такими показателями, как безопасность, эффективность, продолжительность иммунитета при однократном введении, доступность и высокая производительность технологии, а также цена конечного продукта, наиболее предпочтительной для разработки в Казахстане является живая са вакцина.
В основе успеха разработки первой казахстанской живой модифицированной са вакцины против гриппа лошадей стояло получение вакцинного штамма. Данная задача решалась в сотрудничестве с Научно-исследовательским институтом гриппа (НИИ гриппа, Санкт-Петербург, Россия) с использованием метода классической генетической реассортации. В результате этой работы был получен новый вакцинный са штамм А/HK/Otar/6:2/2010, несущий гены, кодирующие поверхностные белки (HA, NA) от дикого штамма A/equine/Otar/764/2007 (Н3N8, американская линия Флорида, клайд 2), и гены, кодирующие внутренние белки (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) от донора аттенуации – са штамма A/Hong Kong/1/68/162/35 (Н3N2). Выбор дикого штамма A/equine/Otar/764/2007 (Н3N8) для конструирования вакцинного вируса обусловлен тем, что он был выделен во время последней эпидемии гриппа лошадей 2007 года в Казахстане и, следовательно, сохраняет актуальность для этой страны. Более того, филогенетически по гену НА данный вирус имеет 99.99% гомологии со штаммом A/equine/ Richmond/1/2007 (Н3N8), который рекомендован Международным эпизоотическим бюро (МЭБ) для производства вакцины против гриппа лошадей [25]. Отдельного внимания заслуживает са штамм A/Hong Kong/1/68/162/35 (Н3N2), который был использован в качестве донора аттенуации. Отличительной чертой этого штамма является то, что полученные с его помощью вакцинные штаммы характеризуются не только безопасностью и эффективностью, но и высокой репродуктивностью в системе культивирования. Так, титр инфекционной активности штамма A/HK/ Otar/6:2/2010, культивируемого в куриных эмбрионах при соблюдении оптимальных условий (доза ви-руса, температура и продолжительность инкубации), стабильно составляет не менее 9.0 log10 ЭИД50/мл (неопубликованные данные). На основе данного са штамма A/Hong Kong/1/68/162/35 (Н3N2) можно без особого труда и за короткий промежуток времени получать новые вакцинные штаммы и актуализировать состав существующих живых гриппозных вакцин. Свидетельством этого является тот факт, что данный штамм с успехом был использован для получения таких вакцинных штаммов, как A/Saint Petersburg/ HK/2009 (H1N1), А/Astana/HK/2009 (H5N1) и А/Perth/ HK/2011 (H3N2) [26]. Следует отметить, что подобным преимуществом не обладает наиболее близкий и единственный коммерческий аналог – вакцина Flu Avert®. Этот коммерческий препарат создавался на основе дикого штамма A/equine/Kentucky/1991 (Н3N8), для аттенуации которого было проведено 49 пассажей в куриных эмбрионах при температуре 26°С. Значит, для актуализации вакцинного штамма этим способом потребуется провести аналогичную работу с диким ВГЛ, которая займет не менее года [11]. Для сравнения, при использовании метода классической реассортации, где в качестве донора аттенуации выступает са штамм A/Hong Kong/1/68/162/35 (Н3N2), на процесс актуализации вакцинного штамма уходит не более трех месяцев. Предыдущими исследованиями [27] было показано, что вакцинный штамм A/HK/Otar/6:2/2010 сохраняет са и ts фенотипы, а так-же проявляет генетическую стабильность на протяжении 20 последовательных пассажей в куриных эмбрионах. Более того, продемонстрирована полная безопасность этого вируса для лабораторных животных (мыши и морские свинки) [28]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что новый реассортантный са штамм A/HK/Otar/6:2/2010 является хорошим кандидатом для живой модифицированной са вакцины против гриппа лошадей.
Дальнейшие испытания разработанной вакцины на жеребятах и жеребых кобылах также продемонстрировали ее безопасность, так как у животных, привитых однократно интраназально в дозе 2 х 109.2 ЭИД50, в течение всего срока наблюдения (21 сутки) не проявлялось признаков какой-либо болезни, включая температурные реакции. Было отмечено лишь незначительное выделение вакцинного вируса (100,75-1,0 ЭИД50/мл) у 12,5-50% привитых жеребят и жеребых кобыл на 1-е и 3-е сутки после вакцинации. Начиная с 7 суток после вакцинации, у привитых животных формировались секреторные антиген-специфичные IgA антитела, а с 14 суток после вакцинации – Т-клеточный иммунный ответ. Интересно, что у привитых жеребят и жеребых кобыл в течение 28-суточного наблюдения (до контрольного заражения штаммом А/equine/Otar/764/2007 (Н3N8) в дозе 108 ЭИД50/животное) в сыворотке крови не обнаруживались антитела к ВГЛ подтипа Н3 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и иммуноферментном анализе (ИФА). Однако при этом у привитых животных наблюдалась выраженная клиническая (по интенсивности и продолжительности признаков болезни, оцениваемых по бальной системе) и вирусологическая (по титру вируса в назальных смывах на 1-14 сутки после контрольного заражения) защита от гомологичного дикого штамма A/equine/ Otar/764/2007 (Н3N8) по сравнению с контрольной группой [29].
Наибольший интерес представляют результаты изучения продолжительности протективного иммунного ответа у лошадей после первичной и повторной иммунизации живой са вакциной против гриппа лошадей подтипа H3N8. Мы впервые продемонстрировали возможность этой вакцины формировать у лошадей клиническую и вирусологическую защиту от гомологичного вируса дикого типа A/equine/Otar/764/2007 (H3N8) в течение 12 месяцев после однократной интраназальной иммунизации [30]. Ранее сообщалось, что данный тип вакцины (коммерческая вакцина Flu Avert®, Heska Corporation) формирует у однократно привитых лошадей протективный иммунный ответ продолжительностью 6 месяцев [2, 9].
Интересен и тот факт, что двукратное интраназальное введение лошадям вакцины с интервалом в 42 дня может не только существенно повысить их клиническую и вирусологическую защиту от вируса дикого типа по сравнению с однократным режимом вакцинации, но и индуцировать стерильный иммунитет (отсутствие вируса в назальных смывах животных после контрольного заражения) на протяжении трех месяцев после повторной иммунизации [30]. Подобные результаты по созданию у лошадей стерильного иммунитета против гриппа ранее были достигнуты с помощью схемы иммунизации, запатентованной компанией Intervet International B.V., Boxmeer (NL) [31]. Согласно этому методу для достижения стерильного протективного иммунитета необходимо сначала вакцинировать лошадей живой са вакциной, а затем – с интервалом не менее 8 недель – провести повторную иммунизацию инактивированной вакциной против гриппа лошадей. О возможности создания стерильного иммунитета у лошадей после контрольного заражения сообщалось также в отношении живой векторной вакцины на основе вируса canarypox, содержащей адъювант Carbopol [32]. Однако сведения о формировании стерильного протективного иммунного ответа у лошадей после двукратного применения только лишь живой са вакцины против гриппа лошадей сообщаются впервые. Еще одним преимуществом двукратной вакцинации по сравнению с однократной является ее способность индуцировать у лошадей выраженную клиническую и вирусологическую защиту от гетерологичного вируса дикого типа A/equine/Sydney/2888-8/2007 (Н3N8) через 12 месяцев после повторной иммунизации [30]. Сравнительный анализ полученных результатов и литературных данных [5, 15, 33, 34] показал, что по созданию продолжительного протективного иммунного ответа у лошадей живая аттенуированная вакцина из реассортантного са штамма A/HK/Otar/6:2/2010 превосходит все известные коммерческие вакцины (инактивированные и рекомбинантные векторные) против гриппа лошадей. Полученные результаты дают основание полагать, что разработанная вакцина может составить хорошую альтернативу инактивиро-ванным и рекомбинантным векторным вакцинам, применяемым в Казахстане и других неблагополучных по гриппу лошадей странах.
Согласно рекомендациям МЭБ, вакцинные препараты против гриппа лошадей должны не только быть безопасными и иммуногенными, но и по возможности обеспечивать дифференциацию инфицированных животных от вакцинированных (Differentiating Infected from Vaccinated Animals, DIVA стратегия) [35]. В настоящее время этим требованиям в полной мере отвечают лишь живые рекомбинантные векторные вакцины, экспрессирующие отдельные поверхностные белки вируса гриппа [36]. В случае применения традиционных инактивированных вакцин также можно дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных с помощью серологических тестов, выявляющих антитела к неструктурному белку NS1 вируса гриппа [37]. Указанные антитела образуются лишь в случае репликации живого вируса гриппа в организме животного. В отношении живых аттенуированных вакцин против гриппа лошадей стратегия DIVA практически невыполнима, так как вакцинный вирус, подобно вирусу дикого типа у привитых животных, вызывает инфекционный процесс. Однако наши серологические исследования наглядно демонстрируют возможность дифференциации инфицированных животных от вакцинированных при применении живой модифицированной вакцины из са штамма A/HK/Otar/6:2/2010 [30]. Суть дифференциации заключается в том, что после первичной, а главное – после повторной иммунизации лошадей данной вакциной у животных в течение 12 месяцев после вакцинации не обнаруживались детектируемые титры (> 1:10) антител в РТГА. Однако на 28-е сутки после контрольного заражения гомологичным (A/equine/Otar/764/2007 H3N8) или гетерологичным (A/equine/Sydney/2888-8/2007 Н3N8) вирусами во всех группах однократно или двукратно иммунизированных лошадей в различные сроки после вакцинации (через 1, 2, 4, 5, 6, 9, 12 месяцев) выявлялись значительные титры антител в РТГА, среднегеометрические (СГТ±95% доверительный интервал) значения которых составляли от 168±27 до 672±144. Полученные данные дают основание полагать, что разработанная вакцина позволяет дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных с помощью такого широко распространенного и доступного серологического теста, как РТГА. Следует отметить, что подобные данные в отношении живых са противогриппозных вакцин сообщаются впервые.
Завершающим этапом цикла лабораторных иссле-дований, нацеленных на разработку вакцины, было проведение комиссионных испытаний вакцины для проверки физических и иммунобиологических ха-рактеристик, а также технологии изготовления в ус-ловиях пилотного производства. По сути, результаты данной работы создают предпосылки для дальнейшего полевого испытания вакцины и ее внедрения в производство. Для этого по разработанной технологии была приготовлена пилотная серия вакцины в объеме 13 400 ампул (134 000 доз). Результаты тех-нологического и биологического контроля показали, что по таким параметрам качества, как внешний вид, наличие посторонней примеси, вакуум в ампулах, растворимость, рН, массовая доля влаги, стерильность, инфекционная активность, безвредность и иммуногенность, вакцина полностью отвечает тре-бованиям (спецификации продукции) проекта нор-мативной документации препарата. Результаты про-веденных комиссионных испытаний в дальнейшем позволили представить, согласовать и утвердить в установленном порядке комплект нормативно-тех-нической документации на биопрепарат [38].
Таким образом, в результате комплексных иссле-дований, начиная от получения вакцинного штамма и завершая комиссионными испытаниями технологии изготовления и свойств препарата, разработана новая безопасная и эффективная модифицированная са вирусная вакцина против гриппа лошадей, которая по ряду свойств существенно превосходит другие коммерческие препараты. Учитывая большой потенциал разработанной вакцины для внедрения в практику, в 2016-2017 годах планируется провести полевые испытания этой вакцины в условиях коневодческих хозяйств Казахстана.