ВВЕДЕНИЕ
Грибы рода Diaporthe Nitschke широко распространены по всему миру. Известны они как сапротрофы, эндофиты и фитопатогены [1], вызывающие заболевания широкого круга экономически значимых сель-скохозяйственных культур; несколько видов, в частности, вызывают фомопсис подсолнечника.
Изучение фитопатогенных видов этого рода обладает несомненной практической значимостью, поскольку точная идентификация видов грибов необходима для понимания эпидемиологии и для принятия корректных мер борьбы с заболеваниями [1]. Приуроченность к растению-хозяину и географическое распространение большинства видов рода Diaporthe на настоящий момент неизвестны.
В стадии бесполого размножения эти микромицеты ранее именовались как виды рода Phomopsis. В настоящее время приоритетным родовым эпитетом следует считать Diaporthe, поскольку этот род был описан ранее, чем род Phomopsis [2]. Традиционно таксономически значимым признаком, использовавшимся для разграничения видов Diaporthe, считались связь с питающим растением и микроморфологические признаки спороносных структур. Поскольку микроморфологические признаки нестабильны и их диапазон варьирования может перекрываться для представителей разных видов, а связи с питающим растением могут не ограничиваться одним видом, на настоящий момент рекомендуется осуществлять достоверную идентификацию представителей рода Diaporthe до уровня вида с применением методов молекулярной филогении и сравнения нуклеотидных последовательностей филогенетически информативных локусов ДНК области внутреннего транскрибируемого спейсера ITS (internal transcribed spacer) рибосомальной ДНК (рДНК), генов β-тубулина, каль-модулина и фактора элонгации трансляции EF-1α (elongation factor) [1, 3].
Ревизия рода, проведённая за последние несколько лет в рамках полифазного подхода к систематике микроорганизмов и основанная на комплексном анализе молекулярно-генетических, микроморфологических, морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков, позволила в корне изменить взгляды на таксономический статус и границы видов рода Diaporthe [1]. Кроме того, в результате проведённой ревизии рода были уточнены ареалы некоторых фитопатогенных видов, обладающих большим экономическим значением.
Изучение биоразнообразия и географии видов Diaporthe в России с применением методов молекулярной филогении и с учётом современной систематики рода не проводилось. Данные о видовом составе и распространении на территории России отдельных видов, особенно обладающих экономической значимостью, требуют уточнения. Согласно доступной нам литературе, на территории России в настоящий момент известны достоверные находки двух видов Diaporthe, подтверждённые молекулярными исследованиями: D. eres на солянке (Salsola tragus) [4] и D. phaseolorum на томате (Т. А. Гуркина, Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2018»).
Представленная работа посвящена идентификации изолята Diaporthe sp., выделенного из подсолнечника, собранного на территории России в Краснодарском крае.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение изолятов
В результате фитосанитарного мониторинга подсолнечника, проведённого в 2016 году на территории Краснодарского края, из стеблей подсолнечника с симптомами пятнистости, типичной для поражения грибом Plenodomus lindquistii, было выделено 65 изолятов. Из них по морфологическим признакам 64 оказались видом Pl. lindquistii, а один – MF 16-010 – был предварительно идентифицирован как Diaporthe sp. Этот изолят и послужил материалом для выполнения работы.
Для выделения грибов из стеблей подсолнечника в чистую культуру поражённый материал был подвер-гнут поверхностной стерилизации. Фрагменты растений последовательно промывали 20 мл раствора, содержащего 2% гипохлорита натрия (NaClO) и 0.1% натрия додецилсульфата (SDS), далее 5% гипохлоритом натрия, три раза стерильной водой, каждый раз активно встряхивая в течение 2 мин и сливая без остатка использованный промывочный раствор. Поверхностно стерилизованные образцы были разложены на картофельно-сахарозную питательную среду (КСА) [5] с добавлением антибиотиков (ампициллин, стрептомицин, пенициллин) и вещества, ограничи-вающего рост грибов (Triton X-100). Чашки Петри ин-кубировали при 24°C в темноте. Учёт производили на 7-10 сутки культивирования. Монопикнидиальные изоляты сохраняли в пластиковых микропробирках на косяках КСА при +4°С. Изолят MF 16-010 задепони-рован в коллекции чистых культур лаборатории ми-кологии и фитопатологии ФГБНУ ВИЗР.
Экстракция и амплификация ДНК
Выделение ДНК из чистой культуры осуществляли согласно стандартному протоколу с использованием цетилтриэтиламмоний бромида (ЦТАБ) и хлороформа [6].
Для последующего секвенирования таксономически информативных локусов и идентификации изолята Diaporthe sp. были амплифицированы: область внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК (ITS-локус), гены β-тубулина и EF-1α с соответствующими парами праймеров: ITS1F [7]/ITS4 [8]; βtub2Fw/ βtub4Rd [9]; EF1-728F/EF1-986R [10].
Реакции были проведены согласно следующему протоколу: каждая ПЦР-смесь (25 мкл) содержала 0.5 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (200 мкМ), 0.5 мкл каждого праймера (ITS1F/ITS4, βtub2Fw/βtub4Rd, EF1-728F/EF1-986R) (25 мкМ), 0.2 мкл Taq-полимеразы (5 ед./мкл) (Евроген, Россия), 10-кратный буфер для полимеразы и 1 мкл раствора ДНК.
ДНК амплифицировали согласно следующему циклу: преденатурация ДНК при 94°С, 2 мин.; денатурация при 92°С, 50 с; отжиг праймеров при 55°C, 40 c (ITS1F/ITS4), или при 52°C, 40 c (βtub2Fw/βtub4Rd), или при 55°C, 60 с (EF1-728F/EF1-986R); элонгация при 72°С в течение 75 с; финальный синтез 3-5 мин при 72°С; количество циклов – 30.
Визуализацию продуктов ПЦР производили с по-мощью электрофореза в 1% агарозном геле с бромистым этидием.
Секвенирование ДНК и анализ нуклеотидных последовательностей
Для секвенирования производили очистку ДНК, полученной после ПЦР, согласно стандартному протоколу [11]. Очищенные фрагменты секвенировали по методу Сэнгера [12] на секвенаторе ABIPrism 3500 в соответствии с протоколами производителя (Applied Biosystems – Hitachi, Япония) с использованием набора реактивов, включающего флуоресцентно меченные дезоксинуклеозидтрифосфаты (BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, ABI, США).
Нуклеотидные последовательности выравнивали с помощью программы ClustalX 1.8 [13], после чего при необходимости корректировали выравнивание вручную. Дендрограммы сходств были построены методом максимального правдоподобия (maximum likelihood – ML) с использованием программного обеспечения RAxML (randomized accelerated maximum likelihood) v. 7.2.8 [14]. Надёжность топологии дендрограммы была оценена с помощью бутстреп-анализа c 1000 случайных повторных выборок. В качестве референсных были использованы полученные из базы данных GenBank [15] последовательности ITSобласти рДНК, генов β-тубулина и EF -1α (Таблица 1).
Вид Diaporthe | Номер штамма | Локус, номера доступа в базе данных GenBank | ||
---|---|---|---|---|
ITS | β-тубулин | TEF | ||
D. ambigua | CBS 114015 | KC343010.1 | KC343978.1 | KC343736.1 |
D. chamaeropis | CBS 454.81 | KC343048.1 | KC344016.1 | KC343774.1 |
D. endophytica | CBS 133811 | KC343065.1 | KC344033.1 | KC343791.1 |
D. infecunda | CBS 133812 | KC343126.1 | KC344094.1 | KC343852.1 |
D. manihotia | CBS 505.76 | KC343138.1 | KC344106.1 | KC343864.1 |
D. phaseolorum | CBS 116019 | KC343175.1 | KC344143.1 | KC343901.1 |
Diaporthe sp. 1 | CBS 119639 | KC343202.1 | KC344170.1 | KC343928.1 |
Изучение морфологических признаков
Для изучения морфологических признаков изолят выращивали на КСА. Инокулированные чашки Петри инкубировали в темноте при 20-22°С в течение 7 дней. Следующие 7 дней чашки инкубировали в режиме «день/ночь»: 13 ч в сутки при ультрафиолетовом излучении (УФ) (эритемные лампы ЛЭ-30, максимум излучения 310-320 нм), 11 ч инкубация в темноте [16]. Учёт признаков проводили на 14-е сутки роста колонии.
Таксономически значимые признаки пикнид и конидий, полученных на КСА, анализировали с помощью методов световой микроскопии с использованием микроскопа Olympus BX53 и бинокулярной лупы Olympus SZX16 (Olympus, Япония).
Оценка патогенности
Оценку патогенности проводили в отношении гибрида подсолнечника Тунка (селекция компании Limagren, Франция) согласно стандартной методике [17, 18, 19]. Инокуляция интактных растений была осуществлена на стадии развития R1-R2 (6-8 пар настоящих листьев, начало бутонизации) [18] в трёхкратной повторности.
В качестве инокулюма использовали агаровые блоки размером 5 мм, высеченные из 10-дневной чистой культуры гриба, выращенной на КСА. Агаровые блоки были помещены на листья и стебли, как с предварительным ранением, так и без него. В качестве отрицательного контроля были взяты растения, инокулированные блоками, высеченными из чистой питательной среды. Учёт размеров некрозов произ-водили на 4-5 сутки после инокуляции. Впоследствии для подтверждения постулатов Коха из заражённых растений был выделен возбудитель и произведена его идентификация.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Молекулярная филогения
Полученные продукты амплификации изолята Diaporthe sp. MF 16-010 имели следующие размеры: фрагмент ITS-области – около 600 пар нуклеотидов (п. н.), гена β-тубулина – 550 п. н., гена EF-1α– 350 п. н. После объединения данных по составу были получены матрицы данных для последующего филогенетического анализа. Длина выровненных последовательностей фрагмента ITS-области составляла 555 п. н., генов β-тубулина – 549 п. н. и EF-1α– 313 п. н. Номера доступа нуклеотидных последовательностей в базе данных GenBank: MH732990, MH734197 и MH768350 соответственно.
В результате молекулярно-филогенетического анализа было построено четыре филограммы: отдельно по каждому локусу и комбинированная для всех трёх локусов.
На всех филогенетических деревьях изолят MF 16-010 с высокой степенью бутстреп-поддержки (96-100%) формировал общую кладу с референсным изо-лятом Diaporthe phaseolorum CBS 116019 (Рис. 1).
Морфология
Изолят MF 16-010 на КСА формировал колонию, характеризующуюся быстрым ростом, обилием светлого воздушного мицелия и многочисленными пикнидами (Рис. 2). В пикнидах размерами 370480×340-370 мкм располагались конидии трёх типов: α, β и γ (Рис. 3). Конидии типа α – бобовидные 6.5-7.25×2.25-2.75 мкм. Конидии типа β – вытянутые нитевидные 15-20×0.75-1 мкм. Конидии типа γимели промежуточные размеры между α и β.
Оценка патогенности
В результате искусственной инокуляции подсолнечника было показано, что изученный изолят MF 16010 вызывает некрозы на стеблях и листьях в 100% случаев при инокуляции с предварительным ранением и не вызывает их при инокуляции без ранения. Средние размеры некрозов через 7 суток после инокуляции составляли: на листьях – 4.00±4.90 мм, на стеблях – 2.33±1.47 мм.
Для подтверждения триады Коха из образовавшихся некрозов был получен реизолят Diaporthe phaseolorum, обладающий морфологическими признаками, идентичными изоляту MF 16-010.
ОБСУЖДЕНИЕ
Длительное время считалось, что на подсолнечнике развивается единственный вид рода Diaporthe – D. helianthi, встречающийся повсеместно в местах возделывания подсолнечника. Этот вид входит в спи-сок карантинных объектов, ограниченно распространённых на территории России [20]. Однако все эти данные о распространении основаны на идентификации возбудителя исключительно по симптомам на растении или по морфологическим признакам, формируемым изолятами в чистой культуре.
На настоящий момент известно, что достоверная идентификация видов Diaporthe может быть осуществлена только с применением методов молекулярной филогении. В результате проведённых исследований, посвящённых ревизии и реиндентификации гербарных образцов поражённого подсолнечника и штаммов Diaporthe, выделенных из подсолнечника, было показано, что на этом растении могут развиваться 14 видов Diaporthe: D. ambigua [21], D. goulteri [19], D. gulyae [19, 22, 23, 24, 25, 26], D. helianthi [19, 22, 23, 24, 25, 26, 27], D. kochmanii [19], D. kongii [19, 26], D. masirevicii [26], D. miriciae [26], D. novem [28], D. sackstonii [26], D. serafiniae [26], D. sojae [22], D. stewartii [23, 29] и D. phaseolorum [1].
Изолят Diaporthe sp. MF 16-010, выделенный из поражённого стебля подсолнечника, собранного в Крас-нодарском крае, по молекулярно-генетическим признакам был идентифицирован как вид Diaporthe phaseolorum, поскольку на всех филограммах, как по ITS-локусу, гену β-тубулина, гену EF-1α, так и на ком-бинированной, он с максимальными степенями бут-стреп-поддержки входил в одну кладу с референсным штаммом D. phaseolorum. В чистой культуре на КСА этот изолят формировал только структуры бесполого размножения – пикниды, содержащие три характерных для представителей рода типа конидий: α, β и γ. В результате искусственной инокуляции подсолнечника этим изолятом было показано, что он является патогенным для данного растения.
Вид D. phaseolorum, согласно информации из литературы, достоверно был обнаружен на растениях семейств Fabaceae: Glycine max [27], Phaseolus vulgaris [22], Euphorbiaceae: Caperonia palustris [27], Cactaceae: Hylocerus undatus [8],Solanaceae: Lycopersicon esculentum (Т.А. Гуркина, Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2018»), Asteraceae: Helianthus annuus [1], Olearia cf. rani, Aster exilis [23]. При эпифитотийном развитии этот фитопатоген может вызывать существенные потери урожая, например, сои – до 70-100% [29]. Известно, что этот вид может также вызывать микозы у людей с ослабленным иммунитетом [30].
Согласно полученным результатам и доступным в литературе данным, изолят Diaporthe phaseolorum MF 16-010 является первой достоверной находкой этого вида на подсолнечнике на территории России.