ВВЕДЕНИЕ
Вирус гриппа А (семейство Orthomyxoviridae, род alphainfluenzavirus) – оболочечный вирус с RNAгеномом, имеющим негативно-полярную стратегию репликации и экспрессии в инфицированных клетках. Геном вируса состоит из 8 сегментов RNA не-гативной полярности, каждый из которых является матрицей для синтеза (транскрипции) позитивнополярных комплементарных mRNA (сRNA), которые транслируются в зараженных клетках с образованием 16 вирусных белков, для некоторых – с использованием механизма сплайсинга и трансляционного сдвига рамки [1, 2]. Восьмой сегмент NS RNA кодирует два белка: неструктурный белок NS1 (27 кДа), обладающий анти-интерфероновой (анти-IFN) активностью, и белок ядерного экспорта (nuclear export protein, 14 кДа) NEP (NS2) – посредством классической негативно-полярной стратегии [1].
Ранее сообщалось, что в сегменте NS закодирован альтернативный путь синтеза третьего вирусного белка посредством прямой трансляции вирионной негативно-полярной vRNA, представленный на Рис. 1 [3-5]. В сегменте NS подавляющего большинства вирусов гриппа A человека выявлена открытая рамка трансляции для дополнительного вирусного белка, так называемого негативно-полярного белка (negative strand protein, NSP) [6]. Оценка эволюции гена NSP во времени методом мультиметрического анализа изменчивости гена у разных вирусных штаммов показала, что ген NSP появился в популяции вирусов гриппа А человека в начале ХХ века [6]. У подавляющего большинства вирусов гриппа А птиц область гена NSP в сегменте NS блокирована присутствием серии стоп-кодонов. По структурным характеристикам, составленным на основе анализа первичной структуры гена NSP различных вирусных штаммов, белок можно отнести к трансмембранным, так как он имеет два выраженных гидрофобных домена в N-и С-концевых областях молекулы и один потенциальный сайт N-гликозилирования [4].
Схематическое изображение генов в сегменте NS вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2). Цифрами обозначены позиции нуклеотидов от 5’-конца vRNA. vRNA – вирионная RNA негативной полярности; cRNA – комплементарная RNA (репликативная форма) позитивной полярности. Экзоны генов для белков NS1, NEP и NSP показаны стрелками. Ломаной линией показана зона сплайсинга mRNA гена NEP. Серым полем обозначена область перекрывания трех вирусных генов: NS1, NEP и NSP.
Ранее нами установлено, что ген NSP белка вируса гриппа, встроенный в геном бакуловируса на-секомых (вируса ядерного полиэдроза), способен экспрессироваться в клетках яичника капустной совки (клеточная линия Н5) [7]. Синтезированный белок в этих клетках имел околоядерную локализацию и, возможно, был связан с мембранами аппарата Гольджи благодаря своим трансмембранным свойствам.
Ранее мы показали, что полноразмерная RNA сегмента 8 (NS) вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) может распознаваться рибосомами и способна в системе in vitro, приготовленной на основе рибосом из клеток млекопитающих, инициировать и направлять синтез вирусных полипептидов с молекулярной массой (м.м.) 23 и 13 кДа, которые специфически реагировали с антителами к пептиду NSP82-119 центральной части белка NSP вируса гриппа А [8]. Эти результаты подтверждают, что vRNA сегмента 8 вируса гриппа A человека (имеющая негативную полярность) обладает матричной функцией трансляции, что согласуется с концепцией о биполярной (амбисенс) стратегии генома вируса гриппа А.
В настоящее время значение обнаруженного гена и возможность экспрессии белка NSP при репликации вируса еще не установлены [9-12]. Однако на важность позитивно-полярного гена в вирусе гриппа A указывает тот факт, что, появившись у вируса гриппа в начале ХХ века, этот ген сохраняется полноценным в геноме современных вирусных штаммов человека, несмотря на выраженную дрейфовую изменчивость вирусного генома [6]. Пока не известно, каким образом и в клетках каких тканей может синтезироваться белок NSP вирусов гриппа А. В случае его синтеза в целостном организме может формироваться специфический гуморальный и (или) клеточный ответ на данный вирусный белок. Наличие такого ответа будет служить подтверждением экспрессии гена NSP и образования данного вирусного белка (или его продуктов) в инфицированном организме.
Для проверки этой гипотезы в настоящей работе исследовали образование лейкоцитов, специфичных к данному белку, после двукратного инфицирования мышей вирусом гриппа А.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Вирусы
В работе использовали вирус гриппа А/WSN/33 (H1N1) и реассортант вируса A/Aichi/2/68 (H3N2) с вирусом А/WSN/33, полученный путем классической реассортации вирусов, содержащий только один ген NS от вируса A/WSN/33, обозначенный как A/Aichi/2/68-WSN (H3N2). Вирусы накапливали в аллантоисной полости 9-дневных куриных эмбрионов.
Титрование вирусов
Для определения инфекционного титра вирусов использовали метод образования инфекционных фокусов в клеточной линии Madin Darby canine kidney (MDCK), как описано ранее [6, 13]. Инфекционную активность вирусных препаратов выражали в фокусобразующих единицах (ФОЕ).
Получение рекомбинантного белка NSP в бактериальных клетках
Для синтеза белка NSP в бактериальной системе E. coli BL21(DE3)pLysS использовали IPTG-индуцируемый вектор pET30a со встроенным геном NSP, включающим аминокислоты 27-158, согласно структуре гена NSP штамма вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1) (Genbank acсession number M12597.1). N-терминальный гидрофобный 26-членный пептид был удален для снижения токсичности синтезируемого белка NSP в клетках E. coli. Укороченный ген NSP, используя праймеры NSP(-sp)/Bgl/fo (tat aag atc tcc aag cga atc tct gta g) и NSPwsnR1/re (tat cga att cgg aac tga cat gac tct tga gg), добавляющие две последовательности 6xHis на N-и C-концах NSP, интегрировали в pET30a между сайтами Bgl-II и Eco-R1. Компетентные клетки BL21(DE3)pLysS трансформировали плазмидой pET30a-NSP(-26)-his+ в буфере TSS (Transformation and Storage Solution) по стандартной схеме с термошоком при 42℃. Положительные колонии отбирали в присутствии канамицина и выращивали ночную культуру в среде Luria-Bertani (LB). Для индукции синтеза белка NSP (расчетная м.м. 19.5 кДa) ночную культуру смешивали с 4 частями среды LB, подращивали в течение 1.5 ч при 37℃, вносили IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали в течение 3.5 ч при 25℃. Клетки осаждали, разрушали ультразвуком, центрифугировали при 12000 g в течение 20 мин при +4℃ для осаждения частиц белка NSP. Осадок растворяли в 5 М мочевине, приготовленной на 50 мМ фосфатном буфере (PBS, рН 7.3), содержащем 0.3% детергента NP-40 и коктейль ингибиторов протеаз (Calbiochem). Очистку белка проводили на Ni -NTA агарозе (Qiagen, Германия) по протоколу производителя. Элюцию белка осуществляли буфером, содержащим 0.3 М NaCl, 0.4 M имидазол, 50 мМ PBS, рН 6.0. Элюат белка NSP диализовали против 50 мМ PBS, рН 7.3. В полученных препаратах содержание белка NSP составляло 60-80%.
Инфицирование мышей вирусом гриппа А
В работе использовали мышей линии Balb/C (массой 10-12 г). Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по этике животных ФГБУ НЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи. Экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Все болезненные процедуры выполнялись под наркозом, чтобы свести к минимуму страдания животных. Животных заражали последовательно вирусом гриппа A/WSN/33 (H1N1) и повторно вирусом-реассортантом A/Aichi/2/68-WSN (H3N2) c интервалом в 4 недели. Мышей заражали интраназально путем вдыхания в течение 2 мин аэрозоля, полученного распылением суспензии вируса с помощью ультразвукового небулайзера «Муссон-1» (Россия). Для генерирования аэрозоля использовали водную суспензию, содержащую около 105 ФОЕ/мл, при вдыхании которой заражающая доза составляла 10-100 ФОЕ/мышь. На 21-й день после заражения собирали сыворотку крови животных, в которой определяли наличие специфических антител к вирусу гриппа в реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА), которую проводили по стандартной методике. Для определения вируса гриппа в легких мышей вскрывали на 3-й день после повторного заражения, собирали бронхолегочные смывы путем промывания легких 1 мл раствора PBS через трахею. Наличие вируса в смывах определяли титрованием методом инфекционных фокусов в культуре MDCK, как описано выше.
Выделение фракции лейкоцитов из селезенки мышей, инфицированных вирусом гриппа
Селезенку от каждой мыши механически разрушали и получали клеточную суспензию, которую осветляли при 170 g в течение 10 мин (Eppendorf 5804/R, ротор FL100). Уровень жизнеспособности клеток в супернатанте, который оценивали по окраске трипановым синим, был не ниже 80%. Далее пробы клеток от каждой мыши вносили в три параллельные лунки на 96-луночный планшет по 1.1-1.6х106 клеток на лунку и культивировали 24 ч при 37℃ в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Gibco BRL). Затем в клеточные пробы вносили иссле-дуемые препараты: контроль (bovine serum albumin, BSA, в конечной концентрации 3 мкг/мл), пептид NSP82-119 (1 мкг/мл), белок NSP (2.5 мкг/мл) или вирус A/Aichi/2/68-WSN (H3N2) (со множественностью ин-фекции 0.01 ФОЕ/клетку) – и клетки дополнительно инкубировали в течение 20 ч. Далее клетки из каждой лунки собирали, осаждали и использовали для выде-ления RNA с последующим анализом уровня mRNA IFNγ и рибосомальной 28S RNA методом ОТ-ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР).
Оценка индукции IFNγ в лейкоцитах методом РВ-ПЦР
Для изучения клеточного иммунитета у мышей после двукратной инфекции вирусом гриппа оценивали степень иммунной реактивности лейкоцитов к белку NSP. В качестве антигена-мишени использовали 38-членный полипептид NSP82-119 с последовательностью аминокислот СTSSSVCPGREGSGEISPTIVPSSVKAL SNIRVSSRSK из центральной области белка NSP вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1), сходной для большинства вирусных штаммов, в котором первая аминокислота лейцин (L) была заменена на цистеин (С) для коньюгирования с белком-носителем KHL (keyhole limpet hemocyanin) при иммунизации [7]. Пептид был синтезирован с 90% степенью чистоты (Quyun, КНР). Степень реактивности лейкоцитов оценивали по уровню внутриклеточной продукции mRNA IFNγ методом РВ-ПЦР со специфическими для гена мышиного IFNγ праймерами (Таблица 1) в лейкоцитах после их контакта с пептидом NSP82-119, очищенным рекомбинантным белком NSP или вирусом гриппа. RNA из лейко-цитов выделяли с помощью набора «Проба-НК» по протоколу производителя (ДНК-технология, Россия). На матрице полученных RNA синтезировали DNAкопии с использованием «случайного» праймера по протоколу набора Reverta-1 (АмплиСенс, Москва). Далее на полученной DNA-матрице ставили РВ-ПЦР с праймерами к гену IFNγ. Для нормализации полу-ченных значений для mRNA IFNγ относительно ко-личества лейкоцитов параллельно в анализируемой пробе оценивали уровень рибосомальной 28S RNA мыши, используя специфические для рибосомальной RNA праймеры (Таблица 1). Значения содержания mRNA IFNγвыражали в условных (арбитражных) еди-ницах (АЕ), нормализованных по количеству рибосо-мальной 28S RNA в анализируемой пробе.
| Назначение праймера | Структура праймера |
|---|---|
| 1. Праймер для синтеза фрагмента 28S RNA (F) | 5’-GCTCATTAAATCAGTTATGGTTC-3’ |
| 2. Праймер для синтеза фрагмента 28S RNA (R) | 5’-GAGGTTATCTAGAGTCACCA-3’ |
| 3. Зонд для детекции 28S RNA | P [R6G]-CGCTCGCTCCTCTCCTACTTGG-[BHQ2] |
| 4. Праймер для синтеза фрагмента IFNγ (F) | 5’-GCCTAGAAAGTCTGAATA-3’ |
| 5. Праймер для синтеза фрагмента IFNγ (R) | 5’- CCAGATATCCAAGAAGAG -3’ |
| 6. Зонд для детекции IFNγ | P [R6G]-TCTTCCACATCTATGCCACTTGA-[BHQ2] |
Электрофорез в полиакриламидном геле и Вестерн-блот (ВБ) анализ
Полипептиды фракционировали в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия (SDS). Белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану Protran 0.45 мкм (Schleicher & Schuell) полусухим методом [13]. Мембрану промывали в PBS, инкубировали 2 ч в 3% обезжиренном молоке и далее в течение ночи при +5℃ в PBS, содержащем 0.5% бычьего сывороточного альбумина (Sigma) и специфические первичные антитела. В работе использовали антитела морской свинки против олигопептида NSP82-119, полученные нами и описанные ранее [7], и монокло-нальные антитела Tetra-His (Qiagen, Германия). Затем мембрану промывали PBS и обрабатывали видо-специфическими антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена (Dako, США), с последующей идентификацией с помощью хемилюминесценции (Enhanced Chemiluminescent, ECL) с супер-субстратом (Pierce, США), как описано ранее [13].
Статистика
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Excel. Для каждой мыши измерения проводили в трех пробах, подсчитывали среднее значение (М) и стандартное отклонение (SD). Данные представляли как M ± SD. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изменчивость гена NSP вирусов гриппа человека подтипа H3N2
В первой части работы мы оценили изменчивость гена и белка NSP в ходе естественной эволюции вируса гриппа. С этой целью проанализировали первичную структуру гена NSP штаммов вируса гриппа человека подтипа H3N2, циркулирующих в период с 1968 г., когда появился данный вирусный подтип, до настоящего времени. Динамика появления мутаций в белке NSP показана на Рис. 2. Видно, что белок NSP претерпевал выраженную изменчивость, которая затрагивала в основном N-и C-концевые области белка, тогда как центральная зона изменялась незначительно. Для оценки скорости изменчивости рассчитывали коэффициент вариабельности (КВ) белка, показывающий количество мутаций на 100 аминокислот в белке в течение года (Таблица 2). Белок NSP имел КВ 0.34, сходный с таковым для наиболее изменчивых поверхностных белков гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA), имеющих КВ 0.4. Полученные результаты позволили также заключить, что выраженная вариабельность N-концевой области NSP детерминирована самим белком NSP, поскольку белки NEP и NS1, имея КВ 0.08 и 0.26 соответственно, не могли дать такую изменчивость. Представленные данные подтверждают, что белок NSP подвержен выраженной эволюционной изменчивости, которая может быть следствием его приспособления к тканевым факторам и (или) параллельно изменяющимся вирусным белкам, с которыми он, возможно, взаимодействует, а также ускользанием от иммунных эффекторов хозяина.
Для составления диаграммы использовали сиквенсы NS генов вирусов гриппа подтипа H3N2, выделенных в период с 1968 по 2018 гг., представленные в информационной базе данных GenBank.
| Вирусные белки | Молекулярная масса белка (Да) | Количество проанализированных последовательностей за 50 лет | Количество выявленных мутантных позиций | Коэффициент вариабельности (КВ) 1 |
|---|---|---|---|---|
| PB1 | 86,000 | 13,215 | 23 | 0.05 |
| PB2 | 87,000 | 13,201 | 34 | 0.08 |
| PA | 85,000 | 13,183 | 47 | 0.1 |
| HA | 75,000 | 19,639 | 139 | 0.4 |
| NP | 56,000 | 13,505 | 58 | 0.2 |
| NA | 56,000 | 17,147 | 114 | 0.4 |
| M1 | 27,000 | 16,145 | 12 | 0.09 |
| NS1 | 27,000 | 13,847 | 34 | 0.26 |
| M2 | 14,000 | 15,438 | 7 | 0.14 |
| NEP | 14,000 | 13,739 | 5 | 0.08 |
| NSP | 25,000 | 14,331 | 37 | 0.34 |
Эволюционную изменчивость белка оценивали по коэффициенту вариабельности, который определяли по количеству аминокислотных позиций в отдельном вирусном белке, претерпевших мутации у штаммов вируса гриппа человека A/H3N2 за период с 1968 по 2018 гг. КВ рассчитывали как общее количество мутантных аминокислотных позиций за один год в расчете на 100 аминокислот в каждом белке. Использовали данные GenBank.
Анализ иммунологических доменов in silico в структуре белка NSP
Результаты компьютерного анализа первичной структуры белка NSP вируса гриппа А по предсказанию эпитопов Т-клеточного и В-гуморального ответов показаны на Рис. 3. Т-клеточные эпитопы идентифицировали с помощью программ, выполненных на основе предсказания связывания пептидных доменов рецепторами MHC-I (major histocompatibility complex-1) [14] и MHC-II [15]. В-гуморальные эпитопы оценивали на основании классического индекса поверхностной экспозиции (алгоритм индекса антигенности) Jameson и Wolf [16]. Как видно на Рис 3, в белке NSP обнаруживаются три Т-эпитопные зоны в позициях аминокислот 10 -25, 40 -50 и 85 -110 (Рис. 3f, g). В-эпитопные зоны выявляются в трех участках с позициями аминокислот 70 -80, 85 -95 и 110 -120 (Рис. 3e), которые имеют низкую гидрофобность (Рис. 3d) и частичное перекрывание с одним эпитопом МНС-II (Рис. 3g). Эти результаты показывают, что пептид NSP82-119, исполь-зованный в настоящей работе, включает два близлежащих эпитопа, распознаваемых как MHC-I (Рис. 3f), так и MHC-II (Рис. 3g) рецепторами. Наличие таких эпитопов в молекуле NSP82-119 может обусловливать иммунный ответ как В-, так и Т-клеточного типа.
Показана первичная структура белка NSP (м.м. 19 кДа), составленная на основании нуклеотидной поcледовательности гена NSP вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1). (а) – Аминокислотная последовательность белка NSP в однобуквенном коде. (b) – Профиль гидрофобности, определенный методом Kyte-Doulittle. (с), (d) – Участки α- и β-структур соответственно, идентифицированные по методу Chou-Fasman. (e) – В-гуморальные эпитопы, предсказанные по методу Jameson-Wolf, индекс антигенности. (f) и (g) – Т-клеточные эпитопы, предсказанные по алгоритму взаимодействия с рецепторами MHC-I и MHC-II. По оси ординат отложено количество аллелей MHC-I (f), способных распознавать каждый из указанных эпитопов, и индекс аффинности взаимодействия 12-членных эпитопов с MHC-II в алгоритме сканирования по длине молекулы NSP (g). Рамками выделены зоны аминокислотных позиций 44 -51 и 82 - 119, соответствующие пептидам, исследованным в работе Zhong et al. [17] и в настоящей работе соответственно.
Характеристика рекомбинантного белка NSP
Идентичность синтезированного в клетках E. coli BL21(DE3)pLysS рекомбинантного белка NSP анали-зировали методом Вестерн-блот со специфическими антителами, полученными к пептиду NSP82-119 и к 6-членному олигопептиду 6xHis. Согласно методике, описанной в разделе «Материалы и методы», синтезированный белок NSP вируса A/WSN/33 содержал два пептида 6xHis на N-и C-концах. Как видно на Рис. 4, была обнаружена одна полоса, реагирующая как с антителами анти-NSP82-119, так и с анти-6xHis и соответствующая ожидаемому размеру белка NSP 19.5 kDa. Важно отметить, что в пробе нетрансформированных клеток этот белок не обнаруживался. Эти результаты подтверждают соответствие экспрессированного в клетках E. сoli рекомбинантного белка NSP соответствующему белку вируса гриппа A/WSN/33 (Рис. 4, дорожка 4).
Рекомбинантный белок NSP вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1), фланкированный на N-и C-концах 6xHis пептидами, экспрессировали в клетках E. сoli BL21(DE3)pLysS и после очистки на Ni-NTA агарозе исследовали методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующим анализом в Вестерн-блоте. Дорожки 1, 3 – контрольный препарат нетрансформированных клеток BL21(DE3)pLysS; дорожки 2, 4 – препарат очищенного белка NSP из клеток BL21(DE3)pLysS, трансформированных плазмидой pET30a-NSP(-26)-his+. В качестве первичных антител использовали антитела Tetra-His (дорожки 1, 2) и антитела, полученные к пептиду NSP82-119 (дорожки 3, 4). Слева показаны позиции маркерных белков с указанием м.м. (кДa).
Развитие инфекции у мышей при последовательном заражении вирусами гриппа подтипов H1N1 и H3N2
Можно ожидать, что при гриппозной инфекции у мышей будет инициироваться формирование иммунного ответа организма-хозяина в ответ на белки вируса гриппа. На начальном этапе работы попытки зарегистрировать отчетливый клеточный иммунный ответ против белка NSP после однократной гриппозной инфекции мышей оказались безуспешными. Чтобы усилить иммунный ответ, применили последовательную двукратную инфекцию мышей с целью вызвать повторное заболевание. Для этого мышей первоначально заражали вирусом гриппа A/WSN/33 (H1N1), ген NS которого кодирует белок NSP с м.м. 19.5 кДа [4]. После выздоровления от первичной инфекции мышей заражали повторно гетерологичным вирусом – реассортантом A/Aichi/2/68-WSN (H3N2), в котором геномный сегмент NS был заменен на таковой от вируса WSN.
Уровень заболевания после первичного инфици-рования мышей вирусом A/WSN/33 оценивали по-средством наблюдения динамики потери веса животных, которая, как известно, отражает тяжесть течения гриппозной инфекции. Как видно на Рис. 5, аэрозольное заражение мышей вирусом гриппа вызывало ха-рактерное замедление прибавки в весе по сравнению с неинфицированными мышами в период с 3-го по 8-й день после заражения. Увеличение веса животных восстанавливалось к 15-му дню от начала инфекции. К 21-му дню после начала инфекции титр анти-гемаг-глютинирующих антител против вируса A/WSN/33 по данным РТГА в сыворотке животных колебался в диа-пазоне 1/40 – 1/160 (данные не показаны). Эти данные подтверждают эффективность заражения мышей и развитие гриппозной инфекции у всех животных.
Мышей линии Balb/c заражали (день 0) вирусом A/WSN/33 (H1N1). На 30-й день мышей повторно заражали реассортантом A/Aichi/2/68-WSN (H3N2). В течение срока наблюдения проводили взвешивание каждой мыши в группе. Стрелкой указан день повторного заражения. Значками ▲ и ● обозначены кривые незараженных и зараженных групп мышей соответственно. Данные представлены как M ± SD.
Через 4 недели после первичного заражения животных инфицировали повторно аэрозольным введением сублетальной дозы реассортанта A/Aichi/2/68WSN (H3N2). Как и при первичном инфицировании, отмечалось замедление динамики прибавки веса, что указывает на развитие инфекционного процесса у животных. Титры вируса в бронхолегочных смывах у мышей на 3-й день после инфекции при повторном заражении варьировали в диапазоне 102–104 ФОЕ/мл смыва у различных особей. Эти результаты подтвердили развитие продуктивной вирусной инфекции после повторного инфицирования.
Через 5 дней после повторной иммунизации у мышей извлекали селезенку, выделяли фракцию лейкоцитов и тестировали уровень сенсибилизации к олигопептиду NSP82-119, гомологичному центральной части NSP и к рекомбинантному белку NSP.
NSP-зависимая иммунная реактивность лейкоцитов у инфицированных животных
Одним из методов оценки формирования клеточного иммунного ответа в организме животных после инфекции вирусом служит определение иммунных лейкоцитов, наличие которых измеряется по уровню индукции IFNγ лейкоцитами животных после их выделения и контакта in vitro с исследуемыми вирусными белками или их пептидами. Для оценки уровня лейкоцитарной mRNA IFNγ используется ОТ-ПЦР в реальном времени [18]. Поэтому для выявления иммунной реактивности лейкоцитов селе-зенки иммунизированных животных на белок NSP на 5-й день после вторичного заражения извлекали селезенку животных, выделяли фракцию лейкоцитов (спленоцитов) и полученные клетки растили в среде RPMI с FBS. Далее клетки сенсибилизировали пептидом NSP82-119 и определяли уровень mRNA IFNγ методом РВ-ПЦР. Параллельно лейкоциты сенсибилизи-ровали двумя препаратами очищенного белка NSP и цельным вирусом. Как видно на Рис. 6, в ответ на стимуляцию лейкоцитов полипептидом NSP82-119 индуцировался IFNγ в количестве, достоверно (p<0.05) превышающем значения, полученные в контроле при стимуляции лейкоцитов с помощью BSA. Количество IFNγ, индуцируемого в ответ на стимуляцию лейкоцитов как первым, так и вторым препаратом рекомбинантного белка NSP, было еще выше (12.0 и 7.8 АЕ, p<0.01). Экспрессия IFNγ в лейкоцитах, сенсибилизированных вирусом, была самой высокой, что логично, поскольку она отражает суммарный эффект эпитопов, присутствующих в антигенах-мишенях, на пептид, рекомбинантный белок и цельный вирус.
У неинфицированных и дважды инфицированных мышей выделяли лейкоциты из селезенки. Лейкоциты инкубировали в среде: (1) – с BSA, (2) – с олигопептидом NSP82-119, (3 и 4) – с рекомбинантным белком NSP из двух различных партий выделения соответственно, (5) – с вирусом гриппа A/Aichi/2/68-WSN. Показаны значения для каждой мыши в группе. Сверху над столбцами представлены средние значения для группы М ± SD. Н – лейкоцитарные пробы неинфицированных мышей. Достоверность разницы результатов оценивали по t-критерию Стьюдента, показаны результаты сравнения групп 1, 2, 3 и 4.
Контрольное тестирование индукции IFNγ при сенсибилизации лейкоцитов неинфицированных жи-вотных пептидом NSP82-119 не показало достоверной индукции IFNγ (p>0.05) (Таблица 3). Незначительный прирост IFNγ после стимуляции неинфицированных лейкоцитов рекомбинантным белком NSP (0.78 АЕ), по всей вероятности, обусловлен остаточной примесью бактериальных белков в препарате белка NSP.Зна-чительная индукция IFNγ (14.5 АЕ) при стимуляции лейкоцитов вирусом вполне логично отражала пер-вичный иммунный ответ спленоцитов на вирус.
| Пробы | Уровень индуцируемого IFNγ (АЕ) | Достоверность различий между пробами |
|---|---|---|
| 1. mock | 0.04 ± 0.02 | --- |
| 2. NSP82-119 | 0.06 ± 0.02 | 2 vs 1, p > 0.05 |
| 3. NSP | 0.78 ± 0.26 | 3 vs 1, p < 0.05 |
| 4. A/Aichi/2/68-WSN | 14.50 ± 5.10 | 4 vs 1, p < 0.01 |
Уровни индукции IFNγ определяли в параллельных пробах из четырех незараженных мышей, как описано в разделе «Материалы и методы». Показаны значения содержания mRNA IFNγ в АЕ. Данные представлены как М ± SD для групп: (1) интактные спленоциты (mock), (2) спленоциты, инкубированные с пептидом NSP82-119, (3) спленоциты, инкубированные с рекомбинантным белком NSP, и (4) спленоциты, инкубированные с вирусом A/Aichi/2/68-WSN.
Полученные результаты показывают, что развитие гриппозной инфекции в организме мышей сти-мулировало формирование клонов сенсибилизиро-ванных лейкоцитов, которые распознают эпитопы белков вируса, в том числе белка NSP, и индуцируют выработку IFNγ.
ОБСУЖДЕНИЕ
В наименьшем по размеру сегменте NS генома вируса гриппа А помимо генов NS1 и NEP выявлена протяженная открытая рамка трансляции (ОРТ) с характерными для полноценного гена ATG-инициаторным и TAG-терминирующим кодонами и структурными элементами для распознавания рибосомами [8]. Главная особенность трансляционной рамки гена NSP со-стоит в том, что она располагается в сегменте RNA негативной полярности в отличие от ОРТ NS1 и NEP, имеющих, как известно, комплементарную геному позитивную полярность (Рис. 1). Особая полярность гена NSP предполагает специфический механизм его экспрессии, который должен отличаться от такового у других вирусных белков. Можно предположить непосредственную трансляцию в инфицированных клетках свободной негативно-полярной NS vRNA до момента ее инкапсидации нуклеокапсидным белком NP. Белок NP образует с RNA вирусные рибону-клеопротеидные комплексы (сегменты) и, вероятно, выполняя роль негативного трансляционного регулятора, закрывает доступ рибосом к RNA. Нельзя исключить и механизм положительной регуляции посредством вирусного белка NS1, который может усиливать трансляцию vRNA в инфицированных клетках [19-21]. Возможно, что клеточные факторы играют решающую роль в экспрессии NSP и определяют тканевой тропизм синтеза данного белка в ин-фицированном организме [22]. В заключение следует отметить, что нельзя исключить существование аль-тернативного механизма синтеза индивидуальной субгеномной mRNA/NSP на матрице позитивной cRNA вируса гриппа в инфицированных клетках.
Предположение о прямой трансляции NS vRNA согласуется с недавними наблюдениями,которые показали способность полноразмерной NS vRNA вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) эффективно транслироваться in vitro рибосомами из клеток млекопитающих с образованием двух полипептидов в 23 и 13 кДа, которые специфически реагировали с антителами к NSP82-119 вируса гриппа А в реакции иммунной преципитации [8]. Этот результат предполагает потенциальную возможность специфической трансляции NS vRNA вируса гриппа в инфицированных клетках.
В настоящей работе получены данные, которые с большой вероятностью свидетельствуют о форми-ровании специфического клеточного иммунного ответа к вирусному белку NSP в организме инфицированных вирусом гриппа А мышей. Эти наблюдения подразумевают образование данного белка (или его компонентов) в процессе вирусной репликации в организме мышей. Косвенные данные об экспрессии гена NSP были получены недавно в опытах на мышах с рекомбинантным вирусом гриппа А/Puerto Rico/8/1934 (A/PR/8), имеющим химерный ген NSP с репортерным индикатором экспрессии [23]. С данными настоящей статьи согласуются также результаты Zhong et al. [17], полученные при изучении иммунного профиля лейкоцитов у мышей после инфекции вирусом A/PR/8 (H1N1). Авторы обнаружили лейкоцитарные клоны, реагирующие с пептидом GGLPFSLL, обозначенным авторами как «гипотетический пептид». Важно отметить, что как этот пептид, идентичный позициям 44-51 аминокислот NSP у вируса A/WSN/33,так и пептид NSP82-119 отчетливо соответствуют Т-клеточным эпитопам, предсказанным в структуре белка NSP (Рис.3g,f).Таким образом,эти результаты подтверждают, во-первых, экспрессию гена NSP в ин-фицированном организме и, во-вторых, присутствие в центральной зоне кодируемого белка NSP домена, обладающего свойствами Т-клеточного эпитопа.
На основании имеющихся данных пока трудно определить уровень и тканевую локализацию синтеза белка NSP (или его продуктов) у инфицированных животных. Более того, ранее предпринимались безуспешные попытки обнаружить образование зрелого белка NSP in vitro в клеточных культурах при заражении вирусом гриппа А [23], (Arikainen A. et al. Does segment 8 of influenza A virus encode a negative-strand polypeptide? 4th Influenza ESWI Conference, Malta 2011, abstract B305P, p. 179). Трудности обнаружения белка NSP могут быть обусловлены его быстрым (возможно, котрансляционным) протеолизом с образованием коротких функциональных пептидов кининового типа. Не исключена возможность экспрессии гена NSP лишь в ограниченном круге клеток в зависимости от специфических факторов, присутствующих только в определенных тканях организма-хозяина.
Кардинальный вопрос: как мог возникнуть новый амбиполярный ген NSP в геноме вируса гриппа А? Появление амбиполярного гена наталкивает на мысль о том, что может существовать пока неизвестный закон соответствия (или правило обратного детерминирования) амбиполярных генов на одном участке молекулы RNA (наличие такой зоны в центре гена NSP показано на Рис. 1 серым полем). В двух других участках ген NSP перекрывается либо с геном NEP (на старте гена), либо c NS1 (на конце гена). Возможно, гипотетический закон состоит в том, что определенный ген может предопределять свойства и механизм возникновения амбиполярного гена. При отсутствии механизма детерминирования следует допустить случайное накопление мутаций, ведущее к появлению нового функционально смыслового гена с последующим отбором. Вероятность такого события мала, учитывая амбиполярное перекрывание нескольких генов, когда изменения в одном гене ведут к изменению в сцепленных амбиполярных генах. В этом случае изменчивость и отбор мутаций должны быть взаимосвязаны сразу в трех вирусных генах: NS1, NEP и NSP.
Результаты настоящей работы могут иметь важное значение для классификации вирусов гриппа. Возникает вопрос о выделении дополнительного рода в семействе Orthomyxoviridae, имеющего амбиполярную (ambisense) стратегию реализации вирусного генома подобно представителям известных вирусных двуполярных родов флебо-, тоспо-, арена-и тенуивирусов [24]. Пока прямой продукт гена NSP не идентифицирован в биологических системах, таких как инфицированные клеточные культуры или организм человека и животных, вопрос о классификации остается открытым. Вместе с тем сохранение полноценного гена NSP в популяции вирусов гриппа человека в те-чение более 100 лет указывает на функциональную необходимость этого гена для пока гипотетической группы амбиполярных вирусов гриппа [6]. Примеча-тельно, что при выраженной эволюционной измен-чивости белка NSP, сходной с таковой для наиболее вариабельных вирусных белков HA и NA, не обнару-живалось появления нонсенс-мутаций, формирующих терминирующие стоп-кодоны, разрушающие ген NSP, что также поддерживает идею о биологической детерминированности данного гена.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при частичной поддержке по грантам РФФИ № 16-04-01271 и № 13-04-001824 и Немецкого научного общества (DFG), SFB1009B2 и GRK2220 EvoPAD. Авторы благодарят академика РАН Г. П. Геор-гиева за полезные обсуждения и д-ра А. С. Червякова за помощь в подготовке статьи. Эти данные были представлены на 6th International Influenza Meeting, Münster, Germany, September 2-4, 2018 (Zhirnov OP, Konakova TE, Isaeva EI. A novel negative-sense polarity protein NSP of influenza A virus in infected mice, Abstract P31, 61)