ВВЕДЕНИЕ
В соответствии с нормативными требованиями окружающая среда при производстве лекарственных средств должна обеспечивать минимальный риск микробного загрязнения продукта. Для подтверждения соответствия данному требованию необходимо регулярно проводить микробиологический мониторинг чистых помещений [1, 2].
Результаты микробиологического мониторинга используются при выборе дезинфицирующих средств, установлении источников микробного загрязнения, а также для оценки эффективности используемого комплекса санитарно-гигиенических мероприятий. Помимо соответствия установленным для данного класса чистоты пределам микробного загрязнения, важен также состав выделяемой микрофлоры, так как присутствие патогенных и некоторых условно-патогенных микроорганизмов – это риск для персонала и продукта [3, 4]. При обнаружении в чистых помеще-ниях микроорганизмов, представляющих опасность для здоровья человека, а также устойчивых к неблагоприятным условиям окружающей среды (например, образующих споры или биопленки), необходимо принимать меры по их устранению [5, 6, 7, 8].
Цель настоящего исследования состоит в изучении закономерностей изменения микробного загрязнения чистых помещений на примере учебно-научного Модуля чистых помещений Отделения биотехнологий ИАТЭ НИЯУ «МИФИ» (Обнинск). Несмотря на то, что изучаемые чистые помещения используются для проведения учебно-исследовательской работы, то есть производимые в них лекарственные средства не предназначены для выпуска на рынок, к ним также предъявляются требования в соответствии с заявленным классом чистоты. Кроме того, выявленные закономерности изменения степени микробного загрязнения в учебно-научном Модуле могут использоваться для усовершенствования процессов в чистых помещениях, функционирующих на фармацевтических предприятиях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом данного исследования является Модуль чистых помещений, включающий в себя четыре помещения класса чистоты D: № 2 – помещение для хранения сырья (5.2 м2), № 3 – гардеробная (14.8 м2), № 4 – производственный участок (40.2 м2) и № 5 – помещение готовой продукции (4.0 м2) (Рис. 1). В исследуемом Модуле поддерживается ламинарный поток воздуха, а также перепад давления между помещениями не менее 10 Па (тип перепада давления – «Каскад»), при этом наибольшее избыточное давление создается в помещении № 4. Системы приточно-вытяжной вентиляции Модуля обеспечивают трехступенчатую фильтрацию приточного воздуха: первая ступень – фильтры класса G4 и F5, вторая ступень – F7, третья ступень – H11. Периодичность проведения генеральной уборки в исследуемых чистых помещениях – не реже одного раза в месяц. Бактерицидные лампы/УФ-рециркуляторы в качестве дополнительной меры по снижению микробного загрязнения не используются.
Точки отбора
2 Помещение для хранения сырья:
2 AS1/2 SP1 – центральная часть помещения
3 Гардеробная:
3 AS1 – «чистая зона»
3 CP1 – дверная ручка
3 CP2 – раковина
3 CP1 – дверная ручка 3 CP2 – раковина
4 Производственный участок:
4 AS1/4 SP1 – возле входа в Гардеробную 4 AS2/4 SP2 – возле гранулятора
4 AS3/4 SP3 – возле таблеточного пресса 4 CP1 – дверная ручка
4 CP2 – раковина
4 CP3 – потолок (рядом с вытяжкой, расположенной возле входа в Гардеробную) 4 CP4 – пол (возле входа в Гардеробную)
4 CP5 – дренажная решетка под раковиной
4 CP6 – вытяжка над гранулятором
4 CP7 – стена (рядом с гранулятором)
4 CP8 – стол (рядом с гранулятором)
4 CP9 – таблеточный пресс (шайба матрицы)
5 Помещение готовой продукции:
5 AS1/5 SP1 – центральная часть помещения
Для оценки состояния исследуемых помещений ежемесячно проводится микробиологический мониторинг. Данные, представленные в работе, были получены в результате микробиологического мониторинга исследуемых чистых помещений в течение двух лет. Мониторинг осуществлялся в местах, наиболее критичных с точки зрения рисков микробного загрязнения: 6 точек контроля воздуха и 11 точек контроля рабочих поверхностей (Рис. 1). Наибольшее влияние на качество продукта может оказать микробное загрязнение производственного участка, поэтому в нем контроль воздуха выполнялся в трех точках, расположенных в зонах с наиболее высоким риском загрязнения: две точки в зоне размещения производственного оборудования и одна – возле входа в гардеробную.
Рабочие поверхности производственного участка контролировались в 9 точках (дверная ручка, раковина, дренажная решетка, потолок и пол возле входа в гардеробную, вытяжка, стена и стол рядом с гранулятором, таблеточный пресс). Остальные помещения предназначены для выполнения менее критичных операций, поэтому отбор воздуха в каждом из них осуществлялся в одной точке, расположенной в центре помещения, а контроль поверхностей – в двух точках в гардеробной (дверная ручка и раковина). Отбор проб проводили в различных условиях эксплуатации помещений: при определении фоновых значений концентрации аэрозольных частиц и микроорганизмов, во время лабораторных работ по имитации производственного процесса с количеством работающего персонала от 5 до 12 человек, после его окончания, во время лабораторных работ по квалификации помещений, а также после очистки помещений. Пробы во время лабораторных работ отбирались спустя 15–20 мин после начала учебного занятия.
Лабораторные работы по имитации производства твердых лекарственных форм включали стадии смешивания, помола и прямого прессования. Во время лабораторных работ по квалификации чистых помещений выполнялось определение счетной концентрации аэрозольных частиц, определение скорости потока воздуха, измерение температуры и влажности воздуха, а также перепада давления. Отбор проб для каждого случая эксплуатации чистых помещений был выполнен трижды, при этом в каждой точке отбиралась одна проба. Контроль воздуха осуществлялся аспирационным и седиментационным методами с использованием чашек Петри диаметром 90 мм, а контроль рабочих поверхностей – методом отпечатка с помощью контактных пластин диаметром 55 мм. Для аспирационного контроля воздушной среды в каждой точке отбиралась проба объемом 1000 л с использованием микробиологического пробоотборника ПУ 1Б («Химко», Россия).
Седиментационный метод контроля воздуха использовали во время лабораторных работ по имитации производственного процесса и после его завершения, а также во время квалификации чистых помещений. Седиментационные чашки экспонировались в течение 4 ч, в случаях производственного процесса объединялись два последовательных этапа отбора (во время производственного процесса с количеством персонала 5 человек/спустя 20–30 мин после его завершения; производственный процесс с количеством персонала 8 человек/производственный процесс с количеством персонала 12 человек). Отбор проб проводился параллельно на две питательные среды производства ООО «ЦФГС» (Россия) с добавками нейтрализаторов (лецитин и твин 80): триптиказо-соевый агар для выделения бактерий и агар Сабуро с декстрозой для выделения дрожжей и грибов [1, 9].
Чтобы минимизировать влияние персонала на результаты, отбор проб воздуха при определении фоновых значений осуществляли с использованием функции прибора «задержка отбора» после выхода персонала из чистых помещений. При отборе проб для определения фонового содержания частиц и микроорганизмов использовали комбинезон, высокие бахилы, шапочку и стерильные перчатки. Комплект одежды, используемый на других этапах отбора проб, соответствовал минимальным требованиям, предъявляемым для класса чистоты D, и включал одноразовый халат, бахилы, шапочку и стерильные перчатки. Отобранные пробы инкубировались в термостате SI500 («Stuart», Великобритания) в течение 5 суток при температуре 30–35°C (бактерии) и 20–25°C (грибы) [1, 9, 10]. Затем проводилась идентификация вида выделенных бактерий с использованием тест-систем «MicrogenID» («Microgen Bioproducts», Великобритания), представляющих собой наборы дегидрированных питательных сред в лунках, и дополнительные биохимические тесты.
Идентификация бактерий выполнялась в следующей последовательности:
– описание культуральных признаков выделенного микроорганизма;
– окраска по Граму и микроскопирование препарата;
– выбор необходимой тест-системы;
– приготовление бактериальной суспензии требуемой плотности в соответствии с инструкцией к тест-системе;
– заполнение лунок бактериальной суспензией;
– учет результатов по окончании требуемого периода инкубации на основании изменения окраски питательных сред и результатов биохимических реакций с помощью прилагаемой к тест-системе базы данных.
Определение видовой принадлежности выделенных плесневых грибов на данном этапе исследования не проводилось (выполнялось только описание культуральных признаков). По полученным данным с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2010 рассчитывалось среднее значение концентрации микроорганизмов в воздушной среде (M) и на рабочих поверхностях, а также стандартное отклонение (SD).
Доля грамположительных кокков, грамположительных и грамотрицательных палочек, а также плесневых грибов рассчитывалась от общего (суммарного) количества выделенных микроорганизмов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты контроля воздуха и рабочих поверхностей (средние значения) для различных случаев эксплуатации чистых помещений представлены в Таблице 1 и на Рис. 2. Как видно из представленных данных, уровень микробного загрязнения воздуха и рабочих поверхностей не превышает допустимых пределов в соответствии с Приказом Минпромторга России от 14.06.2013 № 916: 200 КОЕ/м3 при отборе воздуха аспирационным методом, 100 КОЕ/чашка при определении методом седиментации (за 4 ч) и 50 КОЕ/пластина при контроле поверхностей методом отпечатка с помощью контактных пластин.
| Случай эксплуатации чистых помещений/количество персонала | Состав микроорганизмов в воздушной среде и на рабочих поверхностях | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Грамполо-жительные кокки, % | Грамполо-жительные палочки, % | Грамотрица-тельные палочки, % | Плесневые грибы, % | ||
| 1 | Фон/0 а | 25.0 | 37.5 | 0 | 37.5 |
| 2 | После очистки/2 а | 94.7 | 0.9 | 0.4 | 4.0 |
| 3 | После завершения производ-ственного процесса/2 б | 80.7 | 0.9 | 4.4 | 14.0 |
| 4 | Квалификация/9 б | 70.8 | 0.9 | 1.9 | 26.4 |
| 5 | Производственный процесс/5 б | 80.6 | 1.0 | 3.9 | 14.5 |
| 6 | Производственный процесс/8 б | 80.4 | 1.0 | 6.7 | 11.9 |
| 7 | Производственный процесс/12 б | 96.9 | 0 | 0 | 3.1 |
Приведены средние значения:
– всего 51 замер (методом AS в 6 точках, методом CP в 11 точках; каждое измерение повторено трижды)
– всего 69 замеров (методом AS в 6 точках, методом CP в 11 точках и методом SP в 6 точках; каждое измерение повторено трижды)
Представлен анализ микробного загрязнения воздушной среды аспирационным методом (А), седиментационным методом (Б), а также анализ микробного загрязнения рабочих поверхностей (В). Тип эксплуатации помещений (количество персонала): 1 – Фон (0), 2 – После очистки (2), 3 – После завершения производственного процесса (2), 4 – Квалификация (9), 5 – Производственный процесс (5), 6 – Производственный процесс (8), 7 – Производственный процесс (12).
В составе выделенной микрофлоры преобладают грамположительные кокки, что характерно для чистых помещений в целом [3, 4, 11, 12]. Грамположительные и грамотрицательные палочки присутствуют в исследуемых чистых помещениях практически на всех этапах отбора проб и составляют незначительную долю (менее 10%) от общего количества выделенных микроорганизмов (за исключением проб, отобранных во время определения фоновых значений, где доля грамположительных палочек резко увеличивается). Плесневые грибы также были выделены на всех этапах отбора проб. Идентифицированные в рамках данного исследования микроорганизмы представлены в Таблице 2.
| Грам-принадлежность | Род/вид | Поме-щение | Случай эксплуатации чистых помещений/количество персонала | Точка отбора | Метод отбора |
|---|---|---|---|---|---|
| Грамположитель-ные кокки |
Micrococcus spp.
а
Staphylococcus spp. б | № 2, № 3, № 4, № 5 | Выделены при каждом отборе (воздух, рабочие поверхности) | ||
| Грамположитель-ные палочки | Bacillus firmus | № 4 | Фон/0 | Пол | Контактная пластина |
| После очистки/2 | |||||
| № 2 | После завершения производ-ственного процесса/2 | Воздух | Аспирация | ||
| Bacillus lentus | № 4 | Фон/0 | Пол | Контактная пластина | |
| Bacillus megaterium | № 4 | Фон/0 | Раковина | ||
| Bacillus mycoides | № 4 | Производственный процесс/5 | Дренажная решетка | ||
| Brevibacillus laterosporus | № 4 | Производственный процесс/8 | Таблеточный пресс | ||
| Geobacillus stearothermophilus | № 4 | Производственный процесс/8 | Воздух (возле пресса) | Аспирация | |
| Грамотрицательные палочки | Aeromonas hydrophila | № 4 | Производственный процесс/8 | Дренажная решетка | Контактная пластина |
| Aeromonas salmonicida | № 3 | Производственный процесс/8 | Воздух | Аспирация | |
| Mannheimia haemolytica | № 4 | Производственный процесс/5 | Воздух (возле пресса) | ||
| Pantoea spp. | № 4 | Квалификация/9 | Раковина | Контактная пластина | |
| Pseudomonas stutzeri | № 4 | Квалификация/9 | Воздух (возле гранулятора) | Седиментация | |
| Ralstonia pickettii | № 4 | Производственный процесс/5 | Воздух (возле входа) | Аспирация | |
| Rhizobium radiobacter | № 4 | После завершения производственного процесса/2 | Пол | Контактная пластина | |
| Serratia ficaria | № 4 | Производственный процесс/8 | Дренажная решетка | ||
| Vibrio alginolyticus | № 5 | Производственный процесс/5 | Воздух | Седиментация | |
| Плесневые грибы | Идентификация не проводилась | № 2, № 3, № 4, № 5 | Выделены при каждом отборе (воздух, рабочие поверхности) | ||
Выделено 4 вида, в том числе Kocuria kristinae и Kocuria rosea.
Выделены следующие виды: S. capitis, S. caprae, S. chromogenes, S. epidermidis, S. hominis, S. lentus, S. lugdunensis, S. warneri и S. xylosus.
Всего в результате проведенного исследования выделено 28 видов бактерий. Их видовое разнообразие представлено в основном грамположительными кокками (13 видов). Кроме того, обнаружено 6 видов грамположительных палочек и 9 видов грамотрицательных палочек.
ОБСУЖДЕНИЕ
Чистые помещения как среда обитания микроорганизмов имеют свои особенности. Надлежащая конструкция и эксплуатация чистых помещений способствуют созданию неблагоприятных условий для роста и размножения микроорганизмов, что ограничивает разнообразие колоний микробов в этих помещениях. Основными источниками поступления микроорганизмов в чистые помещения являются персонал, вода, сырье, упаковочные материалы и вносимые в чистые помещения материалы (в том случае, если они не обработаны надлежащим образом) [6, 12].
Результаты исследования подтвердили соответствие изучаемого Модуля чистых помещений классу чистоты D по микробиологической чистоте. Полученные значения по концентрации микроорганизмов в воздушной среде при отборе проб как аспирационным, так и седиментационным методом не превышали установленных пределов микробного загрязнения (менее 200 КОЕ/м3 и менее 100 КОЕ/чашка соответственно) (Рис. 2 А, 2 Б).
Наиболее высокий уровень микробного загрязнения воздушной среды был зафиксирован во время лабораторных работ по квалификации помещений, при этом более четверти выделенных микроорганизмов составили плесневые грибы. Вероятно, объяснением таких результатов может служить длительный (около трех недель) простой чистых помещений, сопровождавшийся отключением вентиляции и отсутствием генеральной уборки.
Кроме того, лабораторные работы по квалификации помещений, в связи со спецификой учебного процесса, сопровождались более активным перемещением персонала, что привело к большему выделению микроорганизмов. Содержание микроорганизмов в воздушной среде на этапе отбора проб для определения фоновых значений концентрации частиц и микроорганизмов (случай 1 на Рис. 2 А) достоверно ниже значений, полученных во время отборов проб в присутствии персонала.
По результатам анализа проб воздушной среды во время производственного процесса не выявлено зависимости концентрации микроорганизмов в воздухе от количества персонала (случаи 5, 6 и 7 на Рис. 2 А). Также не обнаружено статистически значимых различий между концентрацией микроорганизмов в воздухе во время производственного процесса с количеством работающего персонала 12 человек (случай 7 на Рис. 2 А), после завершения производственного процесса (случай 3 на Рис. 2 А) и после очистки помещений (случай 2 на Рис. 2 А).
Полученные результаты говорят о том, что при надлежащей работе системы вентиляции и фильтрации степень микробного загрязнения воздушной среды чистых помещений в зависимости от типа выполняемых работ и количества персонала изменяется незначительно. Основные выводы, полученные при анализе микробного загрязнения воздушной среды аспирационным методом, подтверждаются данными седиментационного анализа (Рис. 2 Б). Однако сравнение соответствующих измерений, проведенных двумя методами (Рис. 2 А и Рис. 2 Б), показывает, что седиментационный анализ – это гораздо менее чувствительный метод.
Уровень микробного загрязнения рабочих поверхностей также соответствовал установленной норме менее 50 КОЕ/пластина (Рис. 2 В). Наблюдалась тенденция к повышению уровня микробного загрязнения рабочих поверхностей с ростом числа работающего в чистых помещениях персонала во время лабораторных работ по имитации производственного процесса (случаи 5, 6 и 7 на Рис. 2 В), однако статистически достоверных различий между уровнем загрязнения при количестве работающего персонала 8 и 12 человек выявлено не было (случаи 6 и 7 на Рис. 2 В соответственно).
Микробное загрязнение рабочих поверхностей во время лабораторных работ по квалификации помещений (случай 4) находилось на уровне, сопоставимом с уровнем загрязнения после проведения очистки помещений (случай 2). Полученные результаты связаны с более тщательной подготовкой персонала ко входу в чистые помещения при проведении лабораторных работ по квалификации помещений, так как непосредственно перед этим проводится практическое обучение персонала процедуре входа/выхода. Кроме того, выполняемый процесс подразумевает меньше контакта персонала с рабочими поверхностями.
По результатам анализа проб в ряду «После завершения производственного процесса» (случай 3) – «После очистки» (случай 2) – «Фон» (случай 1) количество микроорганизмов на поверхностях статистически достоверно снижалось. По результатам идентификации наибольшее содержание грамположительных кокков было зафиксировано на этапах «После очистки» (94.7%) и «Во время производственного процесса» с максимальным количеством работающего персонала (96.9%) (Таблица 1). На этапе «После очистки» полученные результаты могут быть связаны с тем, что основная часть присутствовавших в чистых помещениях микроорганизмов была удалена в результате проведенной очистки, а обнаруженные микроорганизмы, вероятно, были внесены персоналом непосредственно во время отбора проб. Наименьшее количество грамположительных кокков было выделено из проб, отобранных при определении фонового уровня микробного загрязнения. Полученные результаты можно объяснить тем, что влияние персонала на данном этапе было максимально снижено.
Результаты анализов показали, что при наличии работающего персонала увеличивается доля грамположительных кокков. Полученные результаты являются ожидаемыми ввиду того, что основным источником этих микроорганизмов в чистых помещениях служит персонал [3, 4, 12]. Кроме того, эти данные говорят о том, что важно установить максимальное количество персонала для конкретных чистых помещений и не превышать его. Несмотря на численное преобладание, грамположительные кокки редко представляют опасность для окружающей среды чистых помещений, персонала и продукта, так как сравнительно быстро погибают при обработке обычными дезинфицирующими средствами (например, на основе четвертичных аммониевых соединений) [13, 14, 17].
Некоторые из выделенных грамотрицательных палочек могут представлять опасность для чистых помещений. Например, Ralstonia pickettii образует устойчивые биопленки в системах водоподготовки, что вызывает риск микробного загрязнения очищенной воды, используемой в производственном процессе [8]. Aeromonas spp. и Pseudomonas spp. могут представлять опасность для здоровья человека, поэтому их присутствие в чистых помещениях также нежелательно [8]. Источниками данной группы микроорганизмов могли стать вода, персонал и, кроме того, используемое растительное сырье (сахароза) [11]. Оценка микробиологической чистоты этих объектов не входила в задачи данного исследования.
Большинство выделенных видов грамотрицательных палочек (6 видов) обитают в окружающей среде (вода и почва), 2 вида – Mannheimia haemolytica и Pantoea spp. – являются представителями микрофлоры человека; источником Serratia ficaria могут являться как окружающая среда, так и персонал. Практически на всех этапах исследования были выделены представители спорообразующей микрофлоры – грамположительные палочки (Bacillus spp., Brevibacillus spp. и Geobacillus spp.) и плесневые грибы, что говорит о наличии постоянного источника поступления этих микроорганизмов в исследуемые чистые помещения.
На этапе отбора проб для определения фонового уровня микробного загрязнения их доля резко воз-росла. Это можно объяснить тем, что помещения были тщательно подготовлены к работе (очищены) и влияние персонала было минимизировано. В таких условиях были выделены единичные колонии наиболее устойчивых микроорганизмов, обладающих спороо-бразующими формами, проявляющими устойчивость к неблагоприятным факторам, в том числе к дезинфек-ции [8, 13, 14, 16, 17]. Основной причиной появления спорообразующих микроорганизмов в исследуемых чистых помещениях является обувь персонала. Другим источником спорообразующей микрофлоры является упаковочный материал (картонные короба), который используется в помещении № 2 для хранения сырья.
Полученные данные показывают, что изменение степени микробного загрязнения и состава выделяемой микрофлоры имеет сложный характер. Картина микробного загрязнения меняется в зависимости от таких факторов, как количество персонала и типы работ, выполняемых в чистых помещениях. Полученные данные говорят также о необходимости принятия мер для снижения микробной нагрузки в исследуемых помещениях, а именно устранения источников споро-образующей микрофлоры. Для этого необходимо:
– повысить контроль за сменой обуви персоналом;
– отказаться от картонных коробов для хранения сырья и деталей производственного оборудования в помещении № 2;
– еженедельно выполнять генеральную уборку исследуемых чистых помещений с использованием спороцидных средств.
Для оценки эффективности данных мер и в целях повышения контроля микробного загрязнения исследуемых чистых помещений необходимо чаще анализировать уровень микробного загрязнения по-мещений и на постоянной основе выполнять иденти-фикацию выделяемых микроорганизмов.
Кроме того, требуется контролировать используемое сырье и воду на микробиологическую чистоту. Это позволит выявить или исключить потенциальные источники микробного загрязнения чистых помещений, а в случае выявления таких источников – своевременно их устранить.
ВЫВОДЫ
Изучены закономерности изменения уровня ми-кробного загрязнения в чистых помещениях. Показано, что уровень загрязнения рабочих поверхностей и доля грамположительных кокков в воздушной среде и на рабочих поверхностях увеличивается при наличии в помещениях работающего персонала. Степень микробного загрязнения воздушной среды в за-висимости от вида производственного процесса и ко-личества персонала изменяется незначительно.
Исследуемые чистые помещения соответствуют за-явленному классу чистоты D по микробиологической чистоте. Тем не менее необходимо чаще осуществлять контроль микробного загрязнения помещений, а также усилить санитарно-гигиенические мероприятия для устранения источников спорообразующей микрофлоры.
Определена необходимость расширения данного исследования, а именно осуществления контроля микробиологической чистоты используемого сырья и воды, что позволит исключить потенциальные ис-точники микробного загрязнения.