ВВЕДЕНИЕ
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из самых популярных методов амплификации нуклеиновых кислот (НК), применяемых в лабораторной диагностике. Данный метод регулярно используется в клинических лабораториях для выявления микроорганизмов, культивирование которых вызывает определенные сложности.
В связи с высокой чувствительностью ПЦР основной проблемой ее применения является перекрестное загрязнение рабочей зоны, приборов и реактивов ампликонами, которые могут повлиять на результат ПЦР-анализа и привести к ложноположительным результатам [1].
Контаминация рабочих поверхностей и оборудования ампликонами в процессе ПЦР приводит к их реамплификации и контаминированию исследуемого материала, осложняя исследовательские и диагностические работы [1]. Загрязнение ампликонами актуально для всех лабораторий, в которых применяются методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК). Источниками распространения ампликонов являются воздух рабочих помещений, оборудование и одежда сотрудников. Наиболее актуальна эта проблема для клинических и криминалистических лабораторий. Причиной бактериальных загрязнений рабочих поверхностей могут служить также аварийные ситуации. Контаминация проб может привести к ложноположительным результатам анализа [2]. Выявление источника контаминации связано с временными и материальными затратами [3].
В настоящее время для деконтаминации помещений, использующих МАНК, от НК применяются ультрафиолетовое облучение [4], обработка ферментами, расщепляющими молекулы НК [5], или дезинфицирующими средствами (ДС) [3]. В качестве ферментов, способных разрушить ДНК, используются экзонуклеаза III, ДНКаза I и ферменты рестрикциии [6, 7]. Наиболее распространенными ДС, обеспечивающими деконтаминацию ДНК, являются ДС на основе хлорактивных и кислородактивных соединений [3].
Ни один из существующих методов деконтаминации НК не является универсальным [1, 8]. Оборудование может быть крупногабаритным и сложным по конструкции, а также содержать металлические и пластиковые детали, которые чувствительны к воздействию кислот и окислителей. УФ излучение эффективно только для открытых поверхностей и не подходит для приборов сложной конструкции из-за неполного удаления фрагментов ДНК, а также обладает разрушающей способностью в отношении пластмассовых материалов при многократном использовании [9, 10]. Кроме того, большинство распространенных методов деконтаминации недостаточно эффективно для удаления коротких фрагментов ДНК с низкой молекулярной массой (менее 200 п. н.) [11].
Таким образом, существует потребность в поиске надежных и стандартизированных методов деконтаминации поверхностей в лабораториях, использующих МАНК [5]. Обработка ДС остается наиболее дешевым, эффективным и простым для применения методом деконтаминации от НК в лабораторной практике. Однако в отношении деконтаминации поверхностей от НК существует необходимость актуализации перечня средств и методов их применения.
Классические методы, включающие протирание поверхностей помещений и оборудования или погружение в ДС (расходные инструменты), целесообразно применять для частичной (местной) деконтаминации, а при необходимости полной обработки сложных поверхностей большой площади предпочтительнее использовать аэрозольный метод с применением генераторов аэрозоля [12]. Цель данного исследования заключалась в определении эффективных режимов применения ДС при проведении дезинфекции и деконтаминации НК аэрозольным методом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Дизайн эксперимента
Деконтаминацию поверхностей от НК проводили аэрозольным методом ДС на основе перекиси водорода (ПВ), диоксида хлора (ДХ), надуксусной кислоты (НУК), дихлоризоциануровой кислоты (ДХЦК), гипохлорита натрия (ГН). Перечень веществ, активных в отношении НК, был определен ранее [13]. В качестве объекта исследования использовали боксы микробиологической безопасности II класса типа А (Lamsystems, Миасс, Россия). Перед работой проводили обработку согласно СП 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней». Рабочие поверхности ПЦР-боксов контаминировали геномной ДНК или бактериальной культурой Escherichia coli 1257, обрабатывали аэрозолями исследуемых ДС и анализировали степень деградации ДНК.
Штаммы и условия культивирования
В экспериментах использовали штамм E. coli 1257, полученный из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ Оболенск» (B-8556). Культивирование E. coli 1257 проводили в жидкой питательной среде «ГРМ-бульон» (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия) при 37℃ в течение 18 ч в условиях аэрации при 150 об/мин и на плотной питательной среде «ГРМ-агар» (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия) при температуре 37℃ в течение 24 ч.
Выделение геномной ДНК
Выделение геномной ДНК осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции из бактериальной культуры E. coli 1257 [14]. Лизис клеток проводили при добавлении 30 мкл 10% SDS-буфера и протеиназы К. Затем к клеточному лизату добавляли 0.5 мл смеси фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 25:24:1. Образцы перемешивали на Вортекс-шейкере (Biosan, Рига, Латвия) и центрифугировали в течение 10 мин при 12000 g и температуре 4℃. Далее отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую НК. К супернатанту добавляли изопропанол в количестве 80% от объема образца и насыщенный раствор NaCl в количестве 1/9 от объема. Пробы инкубировали 20 мин при температуре 20℃ с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g. К полученному осадку добавляли 400 мкл 70% этанола и центрифугировали 10 мин при 12000 g. Удаляли супернататант и подсушивали образцы до полного испарения спирта. К осадку добавляли 20 мкл однократного ТЕ-буфера pH 8.0 (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА). Концентрацию ДНК в пробах определяли спектрофотометрически (NanoDrop, Thermo Scientific, США). Полученные образцы использовали для определения ДНК методом ПЦР. Оставшийся материал хранили при температуре -20℃.
Оценка деконтаминирующей активности дезинфектантов в отношении НК
Культуру E. coli 1257 выращивали в жидкой питательной среде «ГРМ-бульон» и осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин при комнатной температуре, затем проводили трехкратную отмывку клеток в фосфатно-солевом буфере и выделение НК. В качестве образца ДНК использовали амплификат, полученный в реакции со специфичными праймерами 16S рРНК. Ампликоны в концентрации 1×105 копий/мкл наносили на рабочую поверхность бокса в десяти независимых точках и высушивали при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Для контроля уровня исходной контаминации отбирали пробы ДНК с пяти точек рабочей поверхности бокса. Далее проводили аэрозольную обработку внутреннего пространства бокса исследуемыми дезинфектантами при различных режимах деконтаминации. В качестве отрицательного контроля использовали воду в том же объеме. После экспозиции с оставшихся пяти точек брали смывы, переносили их в раствор нейтрализатора (1.0% раствор тиосульфата натрия) на 10 мин и помещали в отдельные микропробирки с ТЕ-буфером (pH 8.0) (Евроген, Москва, Россия). Из полученных образцов, как описано выше, проводили выделение НК, которую использовали в качестве матрицы при проведении количественной ПЦР в режиме реального времени (РТ-ПЦР) с использованием праймеров гена рибосомальной РНК (рРНК) 16S рРНК.
Отсутствие ингибирования ПЦР исследуемыми средствами подтверждали с помощью внутреннего контроля, как описано у Fischer et al. [11].
Обеззараживание бактериальных культур и НК
Дезинфекцию рабочих поверхностей бокса, загрязненных суточной культурой E. coli 1257, проводили совместно с деконтаминацией внутриклеточной ДНК. Суточную культуру, выращенную на плотной питательной среде «ГРМ-агар», суспендировали в физиологическом растворе до мутности, эквивалентной 3.0 по стандарту МакФарланда (1.0×109-2.0×109 KOE/мл). Полученную бактериальную суспензию наносили на рабочую поверхность бокса в десяти независимых точках и высушивали при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Для контроля уровня исходной обсемененности брали смывы с пяти точек рабочей поверхности бокса. Аэрозольную обработку проводили, как описано ранее, затем из отобранных проб высевали по 0.1 мл на плотную питательную среду «ГРМ-агар», а также выделяли НК и проводили количественную РТ-ПЦР.
Аэрозольная обработка рабочих поверхностей боксов
Внутреннее пространство бокса (0.5 м3) заполняли аэрозолем исследуемых ДС с помощью установки «Мобильный гигиенический центр» (ООО «АСКМ», Санкт-Петербург, Россия). Дисперсность аэрозоля составляла 20-50 мкм (влажный туман) при расходе рабочего раствора 60-200 мл/м3. Время экспозиции после обработки составляло 15 и 30 мин. Распределение аэрозоля по поверхностям бокса определяли экспериментально. Для этого на горизонтальных и вертикальных поверхностях размещали предварительно взвешенные тест-объекты из фильтровальной бумаги размером 10×10 см2 и распыляли 3% раствор ПВ. Объем осажденного раствора рассчитывали по изменению массы тест-объектов после седиментации аэрозоля на поверхности (плотность растворов исследуемых веществ была близка к единице).
Постановка количественной РТ-ПЦР
Количество остаточной ДНК определяли методом РТ-ПЦР на приборе CFX96-touch (BioRad, США) с использованием реактивов qPCRmixHS SYBR («Евроген», Москва, Россия) и специфичных праймеров 16S рРНК. В исследовании использовали праймеры 16S F (5’-CGGAAACGGGCGCTAAT-3’) и 16S R (5’-CCCCACTTTCTCCCTCAGG-3’) [14]. Синтез олигонуклеотидов для исследования осуществляли в ООО «Синтол» (Москва, Россия).
Реакцию повторяли три раза в соответствии с программой: 95℃ – 5 мин (95℃ – 20 сек, 61℃ – 20 сек, 72℃ – 30 сек) × 40 циклов.
Статистический анализ данных
Полученные результаты нормировали по методу Pfaffl [16]. Относительный коэффициент экспрессии (R) вычисляли по формуле , где ∆cq;GOI – изменение порогового цикла гена интереса; ∆cq;REF – изменение порогового цикла референсного гена; E – эффективность реакции. Эффективность реакции рассчитывали путем усреднения эффективности ге-нов во всех лунках при проведении ПЦР в режиме реального времени для каждого гена (E=1.8). Значения изменения порогового цикла референсного гена принимали за ноль. Эффективность деконтаминации поверхностей от микроорганизмов и НК представляли в виде процентных долей. Степень деградации ДНК рассчитывали по формуле согласно Champlot et al. [8]. Эффективность обеззараживания рассчитывали по формуле , где Nd – КОЕ на чашке Петри после обработки ДС; Nc – КОЕ на чашке Петри в контроле (обработка водой).
Обработку и интерпретацию данных осуществляли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism версии 8.0.1 для Windows (GraphPad Software, США, www.graphpad.com). Статистический анализ проводился с использованием непарного t-теста Стьюдента при уровне значимости p<0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Определение расхода рабочего раствора
Важным параметром при аэрозольной обработке поверхностей является расход рабочего раствора, поскольку объем распыленной жидкости влияет на количество осажденных частиц. Количество осажденного раствора после седиментации аэрозоля определяли по изменению массы тест-объектов, размещенных на горизонтальных и вертикальных поверхностях. Массу тест-oбъектов сравнивали до и после обработки аэрозолем.
При расходе рабочего раствора 40 мл/м3 не наблюдалось изменения веса исследуемых тест-объектов. Увеличение объема распыляемой жидкости до 80 мл/м3 выявило наличие небольшого количества осажденного раствора (2-4 мл/м2) на тестируемых объектах. При расходе средства 100 мл/м3 объем осажденного раствора на горизонтальной поверхности составил 20 мл/м2, на вертикальных – 10-13 мл/м2.
При расходе средства 200 мл/м3 наблюдалось двукратное увеличение объема осажденного раствора как на горизонтально, так и на вертикально расположенных поверхностях (Рис. 1). На основании проведенных экспериментов для дальнейших исследований был выбран расход раствора средства в диапазоне от 60 до 200 мл/м3.
Деконтаминация поверхностей от НК
Исследование деконтаминирущей активности дезинфицирующих веществ в отношении коротких фрагментов ДНК размером 94 п. н. проводили аэрозольным методом в условиях, имитирующих загрязнение внутренних поверхностей бокса продуктом ПЦР. Эффективность деконтаминации оценивали по уровню представленности НК в смывах с рабочих поверхностей микробиологических боксов до и после обработки аэрозолями исследуемых соединений. В качестве объектов исследования были выбраны хлорактивные и кислородактивные соединения, перечень и режимы применения которых были определены в ранее проведенных исследованиях [13].
Хлорактивные соединения
Аэрозольная обработка боксов соединениями на основе ДХ, ДХЦК и ГН при расходе рабочего раствора 60 мл/м3 не приводила к деградации нанесенной ДНК. Не было выявлено достоверных различий между опытными и контрольными образцами у всех соединений во всех режимах обработки. При увеличении расхода рабочих растворов до 80 мл/м3 только ГН обеспечивал достоверное снижение уровня представленности ампликонов в пробах на порядок относительно контроля при экспозиции 30 мин (Рис. 2).
Целевые ДНК фрагменты не были обнаружены при обработке бокса 0.03% раствором ДХ при расходе рабочего раствора 100 мл/м3 и экспозиции 30 мин. Увеличение расхода до 200 мл/м3 позволяло снизить концентрацию ДХ до 0.02% при том же времени экспозиции, а увеличение концентрации до 0.03% – сократить время экспозиции до 15 мин (рис. 2А).
Минимальная концентрация ДХЦК, приводящая к разрушению ДНК в течение 30 мин, составила 0.02% при расходе рабочего раствора 100 мл/м3. При увеличении расхода средства до 200 мл/м3 время обработки снизилось до 15 мин (Рис. 2Б).
ГН обладал деконтаминирующей активностью в отношении НК в концентрации 0.1% при расходе раствора 100 мл/м3 и времени экспозиции 15 мин (Рис. 2В).
Кислородактивные соединения
В качестве кислородактивных соединений в исследовании использовали ПВ и НУК. При расходах рабочих растворов от 60 до 80 мл/м3 наблюдали лишь незначительное снижение уровня представленности ампликонов в пробах относительно контрольных образцов. Аэрозольная обработка внутреннего пространства бокса растворами ПВ и НУК в концентрациях 2.0% и 0.24% соответственно вызывала деструкцию НК при расходе средства 100 мл/м3 и времени экспозиции 15 мин (Рис. 3).
Деконтаминация поверхностей от бактерий и внутриклеточной ДНК
Для определения режимов деконтаминации поверхностей от бактерий с одновременным разрушением внутриклеточной ДНК проводили аэрозольную обработку боксов при расходе рабочего раствора 100 мл/м3 в различных концентрациях. Эффективность деконтаминации исследуемыми растворами определяли по снижению уровня обсемененности поверхностей бактериальными клетками и степени деградации их ДНК.
Хлорактивные соединения
Аэрозольная обработка боксов 0.05% раствором ДХ при времени экспозиции 30 мин приводила к разрушению внутриклеточной ДНК, при этом минимальная бактерицидная концентрация (МБК) составила 0.02% при тех же показателях расхода раствора и времени экспозиции (Рис. 4А). Распыление ДХЦК в концентрации 0.0075% при экспозиции 30 мин обеспечивало полную элиминацию бактерий на внутренних поверхностях бокса. Увеличение кон-центрации ДХЦК до 0.03% приводило к деградации ДНК (Рис. 4Б). В отличие от других хлорактивных соединений, ГН обеспечивал деконтаминацию поверхностей от бактерий и НК при одинаковых концентрациях. Эффективный режим применения ГН: 0.1% раствор при расходе 100 мл/м3 и времени экспозиции 15 мин (Рис. 4В).
Кислородактивные соединения
Отсутствие внутриклеточной ДНК в пробах наблюдали при обработке бокса 3.0% раствором ПВ и времени экспозиции 15 мин. Минимальная бактерицидная концентрация ПВ в тех же режимах применения составила 2.0% (рис. 5А). Использование 0.06% раствора НУК вызывало разрушение бактериальных клеток, однако не приводило к деконтаминации поверхностей от НК. При увеличении концентрации раствора до 0.24% наблюдали полное отсутствие бактерий и ДНК на тестируемых поверхностях (Рис. 5Б).
Сравнение режимов аэрозольной деконтаминации
Сравнение режимов аэрозольной обработки при расходе рабочих растворов 100 мл/м3 выявило различия в эффективных концентрациях исследованных соединений, применяемых для деконтаминации лабораторных поверхностей от бактериального загрязнения и НК.
Выявлена корреляция между эффективной концентрацией ДХ и типом контаминации поверхностей (бактерии или ампликоны ДНК), при этом для разрушения внутриклеточной ДНК требовалось увеличение концентрации рабочего раствора. Аналогичные результаты наблюдали при обработке поверхностей растворами ПВ. Показано, что бактерицидная концентрация НУК в четыре раза меньше, чем концентрация, необходимая для удаления НК. В экспериментах с использованием ДХЦК наблюдали зависимость эффективной концентрации рабочего раствора от типа контаминации. Однако при использовании ГН в качестве активного компонента рабочего раствора такая зависимость не наблюдалась (Табл. 1).
Активное вещество | Концентрация активного вещества (%) в рабочем растворе | Время экспозиции, мин | ||
---|---|---|---|---|
Бактерии | Ампликоны | Внутриклеточная ДНК | ||
Диоксид хлора (ДХ) | 0.03 | 0.03 | 0.05 | 30 |
Дихлоризоциануровая кислота (ДХЦК) | 0.0075 | 0.02 | 0.03 | 30 |
Гипохлорит натрия (ГН) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 15 |
Пероксид водорода (ПВ) | 2.0 | 2.0 | 3.0 | 15 |
Надуксусная кислота (НУК) | 0.06 | 0.24 | 0.24 | 30 |
ОБСУЖДЕНИЕ
Классические методы деконтаминации, такие как протирание или орошение, не обеспечивают полного удаления НК с труднодоступных поверхностей. При обработке сложных поверхностей большой площади предпочтительнее использовать аэрозольный метод деконтаминации. В настоящем исследовании мы описали метод обеззараживания поверхностей в лабораториях, использующих МАНК, от бактерий и НК аэрозолями ДС на основе хлорактивных и кислородактивных соединений.
Эксперименты по оценке распределения аэрозоля на тест-поверхностях выявили наличие зависимости объема осажденного аэрозоля от расхода рабочего раствора. При распылении раствора ДС в количестве 60 мл/м3 объем осажденного раствора составил 1-2 мл/м2. Повышение расхода до 100 мл/м3 способствовало увеличению объема осажденного раствора в 10 раз. Предположительно, при данном расходе происходило перенасыщение воздушного пространства боксов частицами аэрозоля, что приводило к их коагуляции и последующему осаждению на поверхность [17].
В ранее проведенных исследованиях [13] для деконтаминации от НК методом протирания применялся 0.01% раствор ДХ при расходе 150 мл/м2. Результаты наших экспериментов показали, что при аэрозольной деконтаминации поверхностей от ампликонов эффективная концентрация ДХ составляет 0.03% при расходе 100 мл/м3, при этом на 1м2 поверхности осаждается 10-20 мл рабочего раствора. Выявлено, что разрушение внутриклеточной ДНК происходит при более высокой концентрации ДХ (0.05%), чем инактивация бактериальных клеток (0.02%). Полученные результаты согласуются с данными исследования, представленными учеными из Китая [18].
При использовании ДХЦК наблюдались аналогичные результаты. В случае деконтаминации ампликонов концентрации растворов при протирании и применении аэрозолей отличались в два раза, а при обеззараживании бактерий и деконтаминации от внутриклеточной ДНК – в четыре раза. Разница в концентрациях при протирании и применении аэрозолей, предположительно, обусловлена тем, что при распылении часть активного вещества теряется в виде газообразного хлора [19]. В соответствии с МУ 1.3.2569-09 деконтаминацию поверхностей от НК необходимо проводить протиранием 0.2% раствором средства ДП-2Т. Проведенные исследования показали, что минимальная эффективная концентрация ДХЦК при применении аэрозолей в 10 раз меньше и составляет 0.02%.
ГН является сильным окислителем, который эффективен против широкого спектра бактерий и вирусов [20-24]. В исследовании Ballantyne et al. [25] показано, что распыление 1% раствора ГН на поверхность приводит к разрушению нанесенной на нее ДНК в течение 5 мин. В экспериментах Nilsson et al. [3] показана эффективность применения ГН в концентрации 0.4% для удаления НК с поверхностей методом протирания. Проведенные нами исследования выявили, что эффективная концентрация ГН при аэрозольной деконтаминации поверхностей от ампликонов, бактерий и их ДНК составляет 0.1%.
ПВ широко применяется как в виде жидкости, так и аэрозоля при обеззараживании различных объектов [26-28]. Свободные перекисные радикалы вызывают окислительное повреждение НК [29]. Результаты исследований показали, что воздействие 2% раствора ПВ приводит к полному разрушению ампликонов и частичной деградации внутриклеточной ДНК. При необходимости удаления бактериальных загрязнений совместно с разрушением внутриклеточной ДНК следует увеличить концентрацию раствора ПВ до 3%. Полученные результаты согласуются с данными исследования Афонюшкина с соавт. [30], показавшими, что применение 2% раствора ПВ обеспечивает инак-тивацию плазмид и снижает концентрацию хромосомной ДНК Cl. perfringens в 28-49 раз.
НУК обладает дезинфицирующей активностью в отношении бактерий, грибков, вирусов и спор [31, 32]. Она разрушает сульфгидрильные (–SH) и дисульфидные (S–S) связи в белках и важные компоненты в мембранах клетки. Гидроксильные радикалы, образующиеся при ее разложении, разрушают клеточные стенки бактерий и приводят к денатурации ДНК [32]. Несмотря на это, в исследовании Zhang et al. [33] показано, что применение растворов НУК способствует лишь частичной деградации бактериальных плазмид и других мобильных генетических элементов. Эти данные согласуются с результатами проведенных нами экспериментов, в которых показано, что для разрушения НК концентрация рабочих растворов НУК должна быть в четыре раза выше, чем при проведении антибактериальной обработки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выявлены эффективные режимы применения хлорактивных и кислородактивных ДС для аэрозольной деконтаминации лабораторных поверхностей от НК. Оптимальный расход рабочих растворов при обработке ПЦР-боксов составил 100 мл/м3, что эквивалентно осаждению ДС раствора на поверхность боксов на уровне 10-20 мл/м2. По сравнению с протиранием при применении ДХ и ДХЦК в виде аэрозолей требовалось увеличение концентрации рабочих растворов в 3 и 2 раза соответственно. При этом эффективные рабочие концентрации растворов ГН, ПВ и НУК не различались в зависимости от способа обработки. Показаны различия в рабочих концентрациях исследуемых ДС при проведении аэрозольной дезинфекции и деконтаминации от НК. При обработке с использованием ПВ и ГН требовалось наименьшее время экспозиции, при этом ГН обладает более низкой коррозионной активностью, что является несомненным преимуществом. Подобранные режимы аэрозольного применения ДС позволяют проводить эффективную деконтамина-цию различных поверхностей сложной конфигурации в лабораториях и снизить токсическую нагрузку на человека и коррозионную на оборудование.