ВВЕДЕНИЕ
Проблема холеры остается актуальной на мировом уровне в связи с продолжающимся пандемическим распространением этой инфекции в большинстве стран мира. Это обстоятельство диктует необходимость всестороннего изучения возбудителя холеры, в частности гидролитических ферментов его поверхностных структур, поскольку они первоначально взаимодействуют с клетками макроорганизма. Гидролазы Vibrio cholerae остаются недостаточно изученными и охарактеризованными, кроме того, в литературе отсутствуют сведения о преобладании активности тех или иных гидролитических ферментов в зависимости от эпидзначимости и происхождения штаммов холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп. Известно, что наличие некоторых гидролитических ферментов может обеспечивать их персистенцию в объектах окружающей среды [1, 2, 3]. В настоящее время велик спрос на надёжные, быстрые и недорогие методы обнаружения гидролитических ферментов, пригодные для обследования разных биологических образцов, включая патогенные бактерии. Одним из таких экспрессных и наглядных методов, не требующих предварительного препаративного выделения ферментов, является реакция радиальной энзимодиффузии (РЭД) [4], которая представляет собой неэлектрофоретический вариант зимографических методов, и поэтому широко используется для определения наличия и количественной оценки суммарной активности гидролитических ферментов в анализируемых биопрепаратах. В основном реакция РЭД выполняется путём помещения образца, содержащего фермент, в прямой контакт с субстратом, растворенным или суспендированным в агаровом или агарозном гелях. При диффузии фермента из лунок в гель по прошествии определённого времени происходит ферментативная реакция, об интенсивности которой судят по наличию зон гидролиза (в виде просветления, или помутнения, окрашивания и т. п.), указывающих на потерю субстрата или появление продуктов ферментативной реакции. В ряде случаев (при использовании суспензий) агарозный гель с субстратом относительно непрозрачен, поэтому зону просветления можно наблюдать без окрашивания. В качестве альтернативы об активности можно судить после кислотного осаждения или после добавления красителя, специфичного для данного субстрата. Образовавшиеся таким образом после инкубации зоны просветления, помутнения или окрашивания и их размер можно использовать как для подтверждения действия определённого фермента, так и для оценки его активности. Теоретически реакцию РЭД можно использовать для определения активности любого фермента при условии, что реакцию «фермент-субстрат» можно визуально контролировать. Однако на практике метод в основном используется для анализа гидролитических ферментов [1]. РЭД – это удобный полуколичественный метод, который не требует дорогостоящего оборудования и пригоден для исследования как разбавленных, так и концентрированных растворов ферментов в малых объёмах. Его можно использовать для анализа образцов неочищенных ферментов, причём на него не влияют ни мутность, ни вязкость растворов последних [1]. В доступной литературе сведений об активности гидролаз разных подклассов методом РЭД у штаммов Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп разной эпидзначимости недостаточно, что обуславливает исследование по данной проблеме.
Цель работы состояла в исследовании препаратов бесклеточных фракций штаммов Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп разной эпидемической значимости и происхождения на наличие гидролаз, относящихся к разным подклассам в реакции энзимодиффузии в агарозных гелях, содержащих соответствующие субстраты.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали бесклеточные фракции (препараты мочевинных экстрактов, препараты наружных мембран, препараты супернатантов культуральной жидкости), полученные из клеток 58 генетически гетерогенных штаммов холерных вибрионов, из которых 23 – токсигенных, изолированных от больных холерой и объектов окружающей среды (ООС) во время вспышек холеры, и 35 нетоксигенных штаммов, выделенных из поверхностных водоёмов в период эпидемиологического благополучия по холере. Из них 11 клинических токсигенных штаммов O1 серогруппы (от больных), 1 штамм классического биовара, 12 нетоксигенных штаммов. Из штаммов O139 серогруппы исследовано 5 штаммов, из которых 3 – клинические токсигенные и 2 – водные нетоксигенные. Бактерии культивировали на агаре Хоттингера (pH 7.6). Суточную культуру каждого штамма вибриона, выращенного при 37°C, смывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР). С целью одновременного лизиса и обеззараживания бактериальную массу (в концентрации 109 микробных клеток (м. к.) в 1.0 мл) обрабатывали стерильным 9 М раствором мочевины в соотношении 1:1 в течение одних суток при комнатной температуре и проводили бактериологический контроль специфической стерильности полученного материала в соответствии с «Инструкцией по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного или холерного микробов» (Саратов, 1982). Полученные лизаты подвергали дифференциальному центрифугирова¬нию с выделением мочевинных экстрактов (МЭ) и наружных мембран (НМ) с последующим диализом и лиофильным высушиванием [5]. Для получения препаратов супернатантов культуральной жидкости (СКЖ) холерные вибрионы первоначально выращивали на щелочном мясопептонном агаре (pH 7.6) при 37°C в течение 24 ч. Суточную культуру смывали физиологическим раствором и засевали во флаконы с мясопептонным бульоном (pH 7.6) в концентрации 108 м.к./мл. После двухчасовой инкубации при комнатной температуре во флаконы для стерилизации засеянной культуры добавляли мертиолят натрия в концентрации 0.01% и бактериальную суспензию выдерживали на холоде в течение двух суток. После контроля и подтверждения специфической стерильности суспензию центрифугировали при 10000 об/мин. Получившийся супернатант бесклеточной жидкости подвергали диализу и лиофильному высушиванию. Образцы для зимографического исследования получали суспендированием лиофилизированных препаратов субклеточных фракций и СКЖ в ЗФР в концентрации 4 мг/мл по белку.
Выявление гидролаз осуществляли с помощью реакции РЭД в 1-1.5% агарозном геле, содержащем для выявления протеаз – желатин, бычий сывороточный альбумин (БСА), иммуноглобулины человека класса G; для выявления липолитических ферментов – Tween-20, Triton X-305 (Sigma-Aldrich, США); для выявления хитинолитических ферментов – гликольхитозан, коллоидный хитин и пептидогликан; для выявления нуклеаз применяли дрожжевую РНК; для выявления муциназ использовали коммерческий препарат муцина; для выявления лецитиназ использовали яичный лецитин; для выявления сульфатаз использовали альгинат натрия и додецилсульфат натрия в 0.5% й конечной концентрации, взятых в качестве субстратов для обнаружения соответствующих ферментов.
Агарозные гели после суточной инкубации обрабатывали 10%-м раствором трихлоруксусной кислоты (в случае использования белковых субстра¬тов), в случае использования небелковых субстратов окрашивали водным раствором Люголя, содержащим 1% йода и 2% йодида калия, 5%-м раствором серной кислоты, 5%-м раствором хлористого кальция в 70% м этаноле и 0.02%-м метиленовым синим. О наличии гидролитической активности судили по образованию зон просветления вокруг лунок в агарозных гелях с использованием опытных и контрольных образцов. В качестве положительных контролей применяли разбавленные растворы ферментов, а в качестве отрицательных – дистиллированную воду, физиологический раствор, растворы инертных белков (бычий сывороточный и яичный альбумины, протаминсульфат). Липолитическую активность оценивали по появлению матовых ореолов – зон липолиза субстрата в виде «колец Сатурна», так называемым «гало» вокруг лунок. Степень гидролиза (зоны просветления, помутнения) определяли по размеру зоны гидролиза от наружного края лунки до окружности зоны просветления (помутнения) в миллиметрах.
Степень активности препаратов оценивали по четырёхкрестной системе, где за + условно принимали размер зоны гидролиза 1-2 мм, ++ – 3-4 мм, +++ – 5-6 мм, ++++ соответствовало размеру зоны гидролиза 7-8 мм и выше. Статистическую обработку данных осуществляли с определением средних величин, их квадратичных отклонений, стандартной ошибки средних показателей в программе Statistica 7.0 для Windows 10. Результаты считали достоверными, если вероятность ошибки не превышала 0.05 (p<0.05) по отношению к контролю (положительный и отрицательный контроли).
РЕЗУЛЬТАТЫ
РЭД-тесты в агарозных гелях, содержащих желатин, БСА и человеческий иммуноглобулин G, показали, что все бесклеточные фракции взятых в работу штаммов холерного вибриона обладают протеазной активностью разной степени интенсивности. Статистически достоверно установлено, что препараты, полученные из нетоксигенных штаммов отличаются большей протеолитической активностью, чем токсигенные: средний размер зон гидролиза у них составляет 7.50±0.02 мм (p<0.05), а у препаратов из токсигенных штаммов – 2.60±0.03 мм (рис. 1А), то есть все препараты из нетоксигенных штаммов отличались большей протеолитической активностью, чем токсигенные.
При использовании в РЭД в качестве субстрата иммуноглобулинов человека класса G установлено, что все препараты МЭ обладают IgG-деградирующей активностью разной степени интенсивности, что выражается в неодинаковых размерах зон гидро¬лиза: у токсигенных он составляет 3.00±0.03 мм, а у нетоксигенных – 1.00±0.03 мм (p<0.05) (Рис. 1Б). Отсутствие зоны гидролиза иммуноглобулина G при использовании трипсина в качестве положительного контроля обусловлено природной устойчивостью молекул иммуноглобулинов к действию протеолитических ферментов [5]. При сравнении общей гидролитической активности в отношении белковых субстратов (желатина, казеина, протаминсульфата, IgG, БСА) между бесклеточными фракциями и препаратами СКЖ отмечена высокая активность последних (9.00±0.04 мм, p<0.05), наибольшей активностью отличались препараты преимущественно нетоксигенных штаммов, что свидетельствует о большей активности секретируемых ферментов. Отмечены различия протеолитической активности между токсигенными штаммами O1 cерогруппы и O139 cерогруппы; так, у препарата МЭ V. cholerae El Tor O1 1263 (ctx+) размер зоны гидролиза желатина был 8.00±0.03 мм, в то время как у МЭ V. cholerae El Tor O1 И-1337 (ctx+) он составлял 2.50±0.03 мм. У препарата МЭ V. cholerae O139 И-12 (ctx+) он составил 3.00±0.03 мм, в отличие от МЭ V. cholerae O139 И-16 (ctx-) (6.00±0.03 мм). Протеолитическая активность большинства препаратов НМ холерных вибрионов обоих серогрупп оказалась ниже по сравнению с препаратами МЭ и СКЖ и составила в среднем 1.50±0.03 мм. Максимальную липолитическую активность в отношении Tween-20 проявили МЭ и НМ нетоксигенных штаммов O1 серогруппы, размер «гало» которых составлял 7.00±0,04 мм и 2.50±0.03 мм соответственно. Однако в отношении Triton X-305 препараты МЭ токсигенных штаммов холерного вибриона O1 и O139 серогрупп показали высокую активность: 8.00±0.03 мм и 5.00±0.03 мм (p<0.05) (Рис. 2А). При изучении активности хитиназ установлено, что препараты бесклеточных фракций и СКЖ из нетоксигенных штаммов обладают большей активностью, чем из клинических токсигенных штаммов, зоны гидролиза коллоидного хитина которых составляют 6.00±0.04 мм (нетоксигенные) и 2.00±0.04 мм (токсигенные) при p<0.05 (Рис. 2Б). Наибольшей лецитиназной активностью отличаются препараты наружных мембран и препараты СКЖ, полученные из токсигенных штаммов, размер зон гидролиза которых составляет (4,6 ±0,03) мм, у нетоксигенных он в среднем составил (1,0±0,04) мм.
Суммарно результаты изучения гидролазной активности препаратов, полученных из штаммов V. cholerae разной эпидзначимости представлены в таблице, где ++++ – высокая активность, +++ – средняя активность, ++ – умеренная активность, + – низкая активность.
При постановке РЭД-тестов на альгинат-лиазную и сульфатазную активности при проявлении агарозных гелей раствором Люголя наблюдаются зоны просветления (5.80±0.03 мм) вокруг лунок с препаратами субклеточных фракций и СКЖ, полученных из токсигенных штаммов, в то время, как у нетоксигенных радиус зон просветления в среднем составляет 3.00±0.04 мм, при сравнении с отрицательными контролями (ЗФР и прокипячённые образцы), а также с образцами, куда был добавлен водный раствор 5% CuSO4 для ингибирования гидролаз (зоны просветления отсутствуют) (Рис. 3А, Б).
Интересно отметить факт быстрого обесцвечивания агарозного геля и исчезновения зон просветления через 10-15 мин после окраски гелей и появление этих зон на агарозном геле вообще без субстрата. При проявлении 0.02% м раствором метиленового синего на наличие альгиназной и сульфатной активности возле лунок с опытными образцами формировались зоны просветления. Они также формировались возле лунок с инертными белками лизоцимом и БСA.Параллельно в отрицательных контролях – в лунках с дистиллированной водой и панкреатической липазой – зон просветления не было. При проявлении чашки с альгинатом натрия 5%-м раствором CaCl2 зоны просветления появились в лунках с препаратами бесклеточных фракций из токсигенных клинических штаммов и отсутствовали в лунках с отрицательными контролями с ЗФР, БСA и протамин сульфатом (Рис. 3Б). Аналогичная картина (зоны просветления) наблюдалась без добавления в агарозу альгината натрия и додецилсульфата натрия. При добавлении в агар, как с альгинатом натрия, так и без него, раствора 2N H2SO4 для осаждения материала видимых изменений на поверхности агара (появления «просветлений») не наблюдали, что свидетельствует о неспецифичности протекающих реакций.
Однако при постановке реакции РЭД в 1%-й агарозе с применением в качестве образцов-контролей L-цистеина (Reanal, Венгрия), овальбумина и глутатиона (Reanal, Венгрия), являющихся донорами водорода тиольных (SH-) групп, и последующей окраской после инкубации чашек раствором Люголя наблюдали зоны просветления по сравнению с отрицательным контролем (буфер), что свидетельствует о протекании окислительно-восстановительных реакций, в результате которых происходит обесцвечивание зоны вокруг лунок (Рис. 4). Это прямо указывает на непригодность использования раствора Люголя для выявления агаразной, альгиназной и сульфатазной активностей.
ОБСУЖДЕНИЕ
РЭД-тесты обследованных препаратов бесклеточных фракций (МЭ, НМ, СКЖ) показали наличие и статистически достоверную разницу активности гидролаз разных подклассов у препаратов, полученных из штаммов V. cholerae O1 и O139 серогрупп разной эпидемической значимости и происхождения – протеаз, хитиназ (преобладание у нетоксигенных штаммов) и лецитиназ, муциназ и липаз (у токсигенных). Обнаружены статистически достоверные межштаммовые различия в степени их активности (размер радиуса зон гидролиза субстрата) при однотипности методик обнаружения. Анализ многочисленных данных литературы показал, что патогенность холерного вибриона и способность его к персистенции в ООС является полидетерминантным, слагающемся из целого ряда факторов и их комбинаций признаком, однако на настоящий момент не все факторы одинаково хорошо изучены. Одним из таких факторов являются гидролитические ферменты – такие, как муциназа и гемагглютинин/протеаза. Они участвуют в деструкции муцина эпителия тонкого кишечника, способствуя дальнейшему распространению холерных вибрионов и усилению связывания холерного токсина с эпителием кишечника, а также гидролизуют такие антимикробные белки, как фибронектин, лактоферрин, овомуцин и секреторный иммуноглобулин sIgA, являющийся фактором локального иммунитета макроорганизма (человека) [6]. Гемагглютинин/протеаза инактивирует CTXφ (умеренный филаментозный фаг V. cholerae, несущий гены ctxAB холерного токсина), предотвращая фаговое инфицирование холерного вибриона. Это позволяет ему выживать в разных экосистемах. Разрушение гликопротеиновых матрикс яиц хирономид, являющихся резервуаром холерных вибрионов разных серогрупп, позволяет вибрионам персистировать в их личинках, что объясняет отсутствие в межэпидемический период вспышек холеры (в неблагоприятных условиях). Наличие хитиназ позволяет холерному вибриону адгезироваться на хитинсодержащих субстратах в окружающей среде, используя их как источник углерода и энергии, что также имеет значение в процессах персистенции. Тогда обнаруженная повышенная хитинолитическая активность нетоксигенных штаммов по сравнению с токсигенными свидетельствует о ее вкладе в адаптационно-приспособительный потенциал нетоксигенных изолятов, выделенных из ООС. Более высокая способность препаратов, приготовленных из нетоксигенных штаммов вибриона El Tor O1 и из токсигенных штаммов холерного вибриона O139 серогруппы, к гидролизу субстратов, содержащих короткоцепочечные жирные кислоты (Tween-20), может быть обусловлена преобладанием в препаратах указанных штаммов эстераз. Более высокая активность препаратов МЭ из токсигенных штаммов в отношении Triton X-305, в состав которых входят длинноцепочечные жирные кислоты, можно связать с действием липаз. Обнаруженные различия в липолитической активности препаратов в отношении используемых субстратов отражают индивидуальные свойства исследованных штаммов и связаны как с разным составом липолитических ферментов, так и с удельной активностью полученных из них препаратов и чувствительностью к факторам внешней среды и в целом демонстрируют интенсивность липидного обмена микробной клетки. Кроме того, более высокая активность липаз, лецитиназ и муциназ у препаратов из токсигенных штаммов может свидетельствовать об их вкладе в патогенный потенциал исходных штаммов. Прослеживается также зависимость степени активности обнаруженных гидролаз в РЭД-тестах от токсигенности исходных штаммов, что может быть использовано для дополнительной фенотипической характеристики штаммов в отношении их потенциальной эпидзначимости и персистентного потенциала. Таким образом, реакция РЭД является подходящим методом для скрининга препаратов бесклеточных фракций холерного вибриона на наличие гидролитических ферментов разных подклассов. При использовании таких проявителей, как растворы йода и метиленового синего, для детекции альгинат-лиазной и сульфатазной активности возникновение таких артефактов, как быстрое появление и исчезновение зон «просветления», их появление на агарозном геле без субстрата и формирование их у лунок с некоторыми инертными белками и аминокислотами (БСА, протаминсульфат, L-цистеин), можно объяснить результатом окислительно-восстановительных реакций молекулярного йода, входящего в состав раствора Люголя, и метиленового синего с SH группами белков анализируемых препаратов [7, 8]. Входящие в состав аминокислот цистеина и метионина, трипептида глутатиона и многочисленных белков тиольные группы, способные к окислению, приводят к обесцвечиванию раствора йода и метиленового синего и, соответственно, к появлению неспецифических реакций, что может привести к неправильной интерпретации полученных результатов (ложноположительных реакций). Растворы йода широко используются для обнаружения агараз, целлюлаз, ксиланаз в агаровых гелях как с субстратами, так и без них, так как считается, что это более быстрый метод по сравнению с другими с применением других красителей [8, 9, 10, 11]. Считалось, что некоторые агаролитические бактерии могут изменять двойную спиральную структуру агара без его разжижения, чтобы он не темнел при «окраске» раствором йода [12]. Однако наши данные позволяют утверждать, что редокс-реакции делают раствор йода непригодным для экспериментов на агаразную, целлюлазную активность в РЭД-тестах. Ранее такое же утверждение было высказано J.A. O’Hair о непригодности использования раствора йода по Граму для выявления целлюлазной активности в РЭД-тестах в агарозных гелях [13].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в препаратах бесклеточных фракций холерного вибриона O1 и O139 серогрупп с помощью реакции РЭД в агарозе нами обнаружена активность гидролитических ферментов, относящихся к разным подклассам. В ходе исследований были выявлены статистически достоверные различия в их активности и обнаружена следующая закономерность: нетоксигенные штаммы отличаются повышенной продукцией протеаз и хитиназ, в то время как токсигенные отличаются повышенной продукцией липаз, лецитиназ и муциназ. В отношении оценки наличия альгинат-лиазной, сульфатазной и агаразной активностей при постановке РЭД-тестов показана непригодность использования для «окрашивания» агарозных гелей растворов йода и метиленового синего, поскольку это может привести к получению ложноположительных результатов. По итогам проведённых исследований реакция энзимодиффузии показала себя надёжным и перспективным методом для определения наличия гидролаз, но в ряде случаев требует осторожной интерпретации полученных результатов. Однако в будущем необходима существенная модификация этого метода. В перспективе результаты исследования могут быть использованы в микробиологической диагностике холеры для дифференциальной биохимической характеристики штаммов холерных вибрионов.